Nachricht

May 09, 2024

Die Variabilität der genomischen Kopienzahl auf Gattungs-, Arten- und Populationsebene wirkt sich auf ökologische In-situ-Analysen von Dinoflagellaten und schädlichen Algenblüten aus

ISME Communications Band 3, Artikelnummer: 70 (2023) Diesen Artikel zitieren 768 Zugriffe 1 Details zu altmetrischen Metriken Die Anwendung von Meta-Barcoding, qPCR und Metagenomik auf aquatische Eukaryoten

ISME Communications Band 3, Artikelnummer: 70 (2023) Diesen Artikel zitieren

768 Zugriffe

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Anwendung von Meta-Barcoding, qPCR und Metagenomik auf aquatische eukaryontische Mikrobengemeinschaften erfordert Kenntnisse über die Variabilität der genomischen Kopienzahl (CNV). CNV ist möglicherweise besonders relevant für funktionelle Gene und beeinflusst Dosierung und Expression. Über das Ausmaß und die Rolle von CNV in mikrobiellen Eukaryoten ist jedoch wenig bekannt. Hier quantifizieren wir die CNV von rRNA und einem Gen, das an der Synthese des Paralytic Shellfish Toxin (PST) (sxtA4) beteiligt ist, in 51 Stämmen von 4 Alexandrium (Dinophyceae)-Arten. Die Genome unterschieden sich innerhalb der Arten um das Dreifache und zwischen den Arten um das Siebenfache, wobei das größte (A. pacificum, 130 ± 1,3 pg Zelle−1 /~127 Gbp) in der größten Größenkategorie aller Eukaryoten lag. Die genomischen Kopienzahlen (GCN) der rRNA variierten bei Alexandrium um 6 Größenordnungen (102–108 Kopien Zelle−1) und standen in signifikantem Zusammenhang mit der Genomgröße. Innerhalb der Population betrug der CNV von rRNA bei 15 Isolaten aus einer Population zwei Größenordnungen (105 – 107 Zelle−1), was zeigt, dass quantitative Daten, die auf rRNA-Genen basieren, erhebliche Vorsicht bei der Interpretation erfordern, selbst wenn sie anhand lokal isolierter Stämme validiert wurden. Trotz bis zu 30 Jahren in der Laborkultur korrelierten die Variabilität der rRNA-CNV und der Genomgröße nicht mit der Zeit in der Kultur. Das Zellvolumen war nur schwach mit rRNA-GCN assoziiert (20–22 % Varianz erklärt bei Dinoflagellaten, 4 % bei Gonyaulacales). Die GCN von sxtA4 variierte zwischen 0 und 102 Kopien Zelle-1, war signifikant mit PSTs (ng Zelle-1) verknüpft und zeigte einen Gendosiseffekt, der die PST-Produktion modulierte. Unsere Daten zeigen, dass bei Dinoflagellaten, einer großen marinen Eukaryotengruppe, funktionelle Gene mit geringer Kopienzahl zuverlässigere und aussagekräftigere Ziele für die Quantifizierung ökologischer Prozesse sind als instabile rRNA-Gene.

Die Variation der genomischen Kopienzahl (CNV) wird zunehmend in eukaryotischen, bakteriellen und archaealen Genomen dokumentiert [1,2,3,4,5] und stellt eine Hauptquelle für genetische Variation innerhalb von Spezies und Populationen dar. Der Einfluss von CNV auf die Expression phänotypischer Merkmale wurde in der Forschung zu Blütenpflanzen, Wirbeltieren, Hefen und der menschlichen Gesundheit, einschließlich vieler Modellorganismen, charakterisiert [1,2,3,4,5]. Eukaryoten-CNVs können zu einer erhöhten Expression und Dosierung führen und einen potenziellen Selektionsvorteil bieten [1, 3, 5,6,7]. Trotz seiner potenziellen Bedeutung ist das Ausmaß und die Rolle von CNV in den meisten Nicht-Modellorganismen, einschließlich mariner mikrobieller Eukaryoten, nur unzureichend verstanden.

Obwohl über CNV in marinen mikrobiellen Eukaryoten berichtet wurde [8,9,10,11,12,13] und einige Studien darauf hingewiesen haben, dass rRNA-Gene in der Kopienzahl oder Sequenz variieren könnten [14, 15], ist es immer noch relativ unklar, ob dies der Fall ist CNV hat einen erheblichen Einfluss auf quantitative molekularökologische Studien, die Meta-Barcoding, Meta-Genomik und qPCR verwenden [10]. Quantitative molekularökologische Studien mariner Protisten nutzen im Allgemeinen Regionen des rRNA-Operons für Gemeinschaftsstrukturanalysen aufgrund der breiten Abdeckung von rRNA-Genen in Referenzdatenbanken, der Fähigkeit zur Auflösung von Taxa und einer hohen genomischen Kopienzahl (GCN) in Eukaryoten (>102). Zelle−1), was die Nachweisempfindlichkeit unterstützt [9,10,11,12]. Bei Tieren, Pilzen und Pflanzen sind jedoch rRNA-Genkopien unterschiedlich vorhanden, von 102–104 Kopien Zelle-1 [9, 10, 16,17,18], mit einem ähnlichen Bereich (103–104 Kopien Zelle-1) in Kieselalgen (Stramenopiles) [19]. Andere Gruppen mikrobieller Eukaryoten können eine größere Variation aufweisen, von 103–105 Kopien Zelle-1 bei Ciliaten (Alveolata) [11] und 102–105 bei Foraminiferen (Rhizaria) [12]. Bei den meisten Arten mikrobieller Eukaryoten gelten die Kopienzahlen der rRNA-Gene als stabiler [19, 20], allerdings haben relativ wenige Studien dies untersucht [11, 12, 19].

Dinoflagellaten umfassen die meisten schädlichen Algenblüten (HAB) bildenden Taxa und machen bis zu 50 % der marinen mikrobiellen eukaryontischen Biomasse aus. Sie sind somit ein Hauptbestandteil aquatischer mikrobieller Ökosysteme [13]. Die Genomgröße variiert bei Dinoflagellaten erheblich (~1 Gb bis >150 Gb), einschließlich einiger der größten bekannten eukaryotischen Genome, die größer sind als die größten Tiergenome (Lungenfisch, 130 Gb) und Pflanzengenome (Paris japonica, 149 Gb) [21,22, 23,24,25]. Bei Dinoflagellatengenomen scheint es zu Genduplikationen und großräumiger Expansion gekommen zu sein, und kodierende Gene sind oft in mehreren Tandemwiederholungen vorhanden [26,27,28,29,30]. Genome von Korallensymbiontenarten (Dinophyceae: Symbiodinaceae) zeigen eine hochdynamische Entwicklung, die durch die Erweiterung der Genfamilie sowohl durch Tandemduplikation (28, 29) als auch durch Retroposition (31, 32) vorangetrieben wird. Erhebliche Variationen der Genomgröße und sehr große Genome kommen in mehreren planktonischen Dinoflagellatenordnungen vor [33] sowie in anderen Gruppen mariner mikrobieller Eukaryoten wie Foraminiferen, Ciliaten und Amöbozoen [33]. GCN von rRNA-Genen in weiten Teilen des eukaryotischen Lebens werden als weitgehend mit der Genomgröße korreliert [18]. Derart große und dynamische Genomgrößen lassen darauf schließen, dass in diesen Taxa möglicherweise erhebliches CNV vorhanden ist.

Unter den meeresschädlichen Algenblüten, die Taxa bilden, sind solche, die Paralytic Shellfish Toxine (PSTs) produzieren, weit verbreitet und haben erhebliche Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit und die Wirtschaft [34]. Die PST-Expression kann einen induzierbaren Abwehrmechanismus in marinen Dinoflagellaten als Reaktion auf die Anwesenheit von Copepoden-Raubtieren darstellen [35]. PSTs werden von den kosmopolitischen und häufig vorkommenden marinen Dinoflagellaten der Art Alexandrium, Pyrodinium bahamense, Gymnodinium catenatum und Centrodinum punctatum synthetisiert. Dinoflagellaten-Gene, die mit der PST-Biosynthese (sxt) assoziiert sind (36, 37, 38), besitzen Dinoflagellaten-Merkmale wie eine einzigartige gespleißte 22-bp-Leadersequenz auf Transkripten, einen hohen GC-Gehalt und eukaryontische Poly-A-Schwänze (36, 38). Es wird angenommen, dass ein relativ geringer Anteil der Gene (~10–27 %) in Dinoflagellaten auf Transkriptionsebene reguliert wird [21, 23, 26], wobei viele Gene posttranskriptionell reguliert werden. Die Rolle der Gendosis, die auf dieses Merkmal einwirkt, kann daher bei Dinoflagellaten eine andere sein als bei stärker transkriptionell regulierten Taxa. Studien an bestimmten Arten wie A. minutum und A. ostenfeldii haben darauf hingewiesen, dass möglicherweise ein Zusammenhang zwischen dem zellulären PST-Gehalt und genomischen Kopien des PST-Biosynthesegens sxtA4 besteht [39,40,41]. Einige Studien haben gezeigt, dass die PST-Synthese möglicherweise nicht auf Transkriptionsebene reguliert wird [42, 43]. Es wurde festgestellt, dass dieses Gen im GCN in allen Studien variiert, da A. pacificum und A. catenella ~180–325 Kopien Zelle-1 von sxtA4 aufweisen [40, 44, 45]; während A. minutum und A. ostenfeldii mit 1,5–11 Kopien Zelle-1 weniger Kopien zeigten [39, 41]. Die meisten Arten von Alexandrium hatten keine nachweisbaren sxtA4-Kopien und produzieren keine PSTs [46]. Somit ist sxtA4 ein Gen mit einer vergleichsweise geringeren Kopienzahl in Dinoflagellaten als solchen, die Tandemwiederholungen in großem Maßstab aufweisen [26,27,28,29,30]. Wenn GCN bei allen PST-produzierenden Arten konsistent ist, kann es einen nützlichen Marker für ökologische In-situ-Analysen von HABs und möglicherweise für andere funktionelle Merkmale darstellen, die von der genomischen Dosierung bestimmt werden.

Da rRNA-Gene im Vergleich zu kodierenden Genen wahrscheinlich einem unterschiedlichen Selektionsdruck unterliegen [47], können sich die Prozesse, die zu CNV führen, zwischen ihnen unterscheiden. Um den Einfluss von CNV sowohl auf ein funktionelles Gen als auch auf rRNA-Barcode-Marker zu bestimmen und die Rolle der Genomgröße und der Zeit in der Kultur auf CNV zu untersuchen, haben wir CNV von rRNA-Genen und sxtA4 im Verhältnis zur Genomgröße über 51 PST-Stämme quantifiziert. produziert marine Dinoflagellaten, Alexandrium australiense, A. pacificum, A. catenella und A. minutum. Unsere Auswahl an Stämmen ermöglichte die Untersuchung des CNV innerhalb und zwischen Arten, in Stämmen, die in Langzeitkulturen gehalten wurden, und der CNV-Varianz zwischen Regionen. Da Diversitätsanalysen, insbesondere unter Verwendung von rRNA-Genen, allgegenwärtig werden, wollten wir das Ausmaß der mit CNV verbundenen Verzerrungen bestimmen, seine Prävalenz bei Dinoflagellaten untersuchen und mögliche Lösungen aufzeigen.

Fünfzehn nicht-axenische Stämme von Alexandrium pacificum wurden aus einem Oberflächennetzfang ermittelt, der am 22.11.18 in Mindarie Marina, Westaustralien (−31.689127, 115.703103) gesammelt wurde. Die Einzelzellisolierung von A. pacificum wurde mit herausgezogenen Glaspipetten und einem inversen Nikon Eclipse TS100-Mikroskop (100-fache Vergrößerung) durchgeführt. Isolierte Zellen wurden in Falcon®24-Well-Kulturplatten übertragen, die 1 ml K/5-Medium [48] ohne Natriumsilikat enthielten. Germaniumdioxid wurde zugesetzt (5 µg/ml), um das Wachstum von Kieselalgen zu verhindern. Die Platten wurden bei 18 °C unter einem Photonenfluss von 60–100 μmol Photonen PAR m−2 s −1 mit einem 12/12-stündigen Dunkel-/Hell-Zyklus (kaltweiß fluoreszierend) gehalten. Nach 3 Wochen wurden die Kulturen in 20 ml K-Medium in 70 ml sterilen Kulturflaschen (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) überführt und alle 3 Wochen durch serielle Übertragung aufrechterhalten. Insgesamt wurden 36 zusätzliche Stämme von 4 Alexandrium-Arten (Alexandrium catenella, A. minutum, A. pacificum, A. australiense; Ergänzungstabelle 1) aus Sammlungen erhalten: der Australian National Algae Culture Collection (CS), der Cawthon Institute Culture Collection von Microalgae (CAWD), die Roscoff Culture Collection (RCC) und Sammlungen des Institute for Marine and Antarctic Studies der University of Tasmania. Die Stämme stammen aus acht verschiedenen Ländern in Europa, Asien, Australasien und Amerika sowie aus verschiedenen Bundesstaaten und Regionen Australiens und wurden in den letzten 30 Jahren zu unterschiedlichen Zeitpunkten isoliert.

Die Identität des Isolats wurde durch Sequenzierung der D1-D3-Region der rRNA großer Untereinheiten bestätigt. Zellen wurden aus 50 ml Kultur durch Zentrifugation geerntet und DNA mit dem FastDNA Spin Kit für Boden (MP Biomedicals, Santa Ana, Kalifornien, USA) extrahiert. Die DNA-Qualität wurde mit einem Nanodrop 2000-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts) überprüft. Die D1-D3-Region der LSU-rRNA wurde durch PCR unter Verwendung der Primer D1F [49] und D3B [50] in 25-µl-Reaktionen mit 5 µl 5X MyTaq-Puffer (Bioline, London, UK), MyTaq-Polymerase (Bioline, London, UK) amplifiziert. UK) 0,5 µl, 7,5 pmol jedes Primers, 1 µg µl−1 BSA (Biolabs, Arundel, Australien), 1 µl DNA und 15,5 µl DNA-freies Wasser. Die PCR-Bedingungen waren 5 Minuten lang 94 °C, gefolgt von 35 Zyklen: 30 Sekunden lang 94 °C, 30 Sekunden lang 56 °C und 1 Minute lang 72 °C; und ein letzter Verlängerungsschritt von 3 Minuten. PCR-Produkte wurden durch 1 % Agarosegelelektrophorese verifiziert, mit GelRed (Gene Target Solutions, Dural, Australien) gefärbt und mit Zymoclean™ (Zymo Research, Kalifornien, USA) gereinigt. Die Sanger-Sequenzierung der Produkte wurde von Macrogen (Südkorea) durchgeführt, wobei die Stämme A. pacificum, A. catenella, A. minutum oder A. australiense zugeordnet wurden, basierend auf Vergleichen mit Sequenzen aus verifizierten Isolaten jeder Art.

Zur Messung der Genomgröße, CNV und PSTs wurden Alexandrium spp. wurden in GSe-Medium [51] bei 18 ° C bis zur exponentiellen Phase gezüchtet. Zur Messung der Genomgröße zellzyklussynchronisierter Stämme wurden die Zellen dann 48 Stunden lang im Dunkeln inkubiert, um die Synchronisierung der Zellteilung zu induzieren [52, 53]. Teilproben wurden zum Zeitpunkt der Ernte mit Lugol-Jod fixiert und die Zellkonzentration mithilfe einer Sedgewick-Rafter-Zählkammer (ProSciTech, Australien) und einem Umkehrlichtmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) bestimmt. Zur CNV-Quantifizierung mit qPCR wurden ~60–75 × 103 Zellen in dreifacher Ausfertigung von jedem Stamm durch Zentrifugation (10 Minuten bei 1000 g) geerntet. Zur Quantifizierung der Genomgröße mittels Durchflusszytometrie wurden von jedem Stamm etwa 105 Zellen in dreifacher Ausfertigung geerntet. Mindestens 106 Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 1000 g zur PST-Messung geerntet.

Die Zellen wurden mit 1 × PBS gewaschen, 10 Minuten lang mit 1 % (Gew./Vol.) Paraformaldehyd fixiert und dann erneut mit 1 × PBS gewaschen. Zellpellets wurden in 2 ml kaltem Methanol resuspendiert, mindestens 12 Stunden bei 4 °C gelagert, um das intrazelluläre Chlorophyll zu entfernen, zweimal mit 1x PBS gewaschen und dann > 3 Stunden lang in 0,1 mg mL-1 Propidiumiodid gefärbt 2 µg mL−1 RNAse (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland).

Für die Durchflusszytometrieanalyse wurde ein CytoFLEX S-Durchflusszytometer (Beckman Coulter, Kalifornien, USA) verwendet, das mit einer Laseranregung bei 488 nm ausgestattet war. Als Standard wurden BD™ DNA QC-Partikel Hühnerblutzellen (3 pg DNA/Kerne; BD Biosciences, San Jose, USA) verwendet [54]. Insgesamt wurden 2-µm-Fluoreszenzkügelchen als stabile Partikel zur Überprüfung der Instrumentenausrichtung verwendet (BD Biosciences, San Jose, USA). Dreifache Proben wurden mit 30 µL min-1 analysiert und die Daten im linearen und logarithmischen Modus erfasst, bis mindestens 10.000 Ereignisse pro Probe gemessen wurden. Die Fluoreszenzemission von mit Propidiumiodid gefärbter DNA wurde bei 610 ± 10 nm nachgewiesen. Die Peakverhältnisse und der Variationskoeffizient (CV) wurden mit der CytExpert-Software (Beckman Coulter, Kalifornien, USA) quantifiziert. Als Auslöser wurde der FSC-Kanal mit automatischer Einstellung vom Hersteller verwendet. Gating und weitere Analysen wurden nur für Peaks mit CV-Werten unter 20 % durchgeführt und alle Peaks darüber wurden erneut durchgeführt. Das Gating wurde unter Verwendung des FSC-A- vs. SSC-A-Gates durchgeführt, um Ablagerungen auszuschließen, und des PI-Gates im Histogramm, um starkes Hintergrundrauschen ohne den DNA-Gehalt zu entfernen. Für die Genomgröße in Basenpaaren wurde ein Umrechnungsfaktor von 1 pg DNA = 978 Mbp verwendet [55].

Die DNA-Extraktion wurde mit einem PowerSoil DNA Extraction Kit (QIAGEN, OH, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die DNA wurde dreifach extrahiert und Qualität und Quantität mit einem Nanodrop ND-1000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts) und einem Qubit 2.0 Fluorometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts) bestimmt. qPCR wurde mit einem BioRad CFX384 Touch™ System (BioRad, Kalifornien, USA) unter Verwendung artspezifischer qPCR-Assays für Alexandrium-rRNA-Gene (56) und sxtA4 (44) durchgeführt (Ergänzungstabelle 5, Ergänzungsabbildung 8). qPCRs wurden dreifach unter Verwendung der folgenden Zyklusparameter durchgeführt: 95 °C für 10 s, 35 Wiederholungen von 95 °C für 15 s und 60 °C für 30 s. Das Gesamtreaktionsvolumen betrug 10 μl und enthielt 5 μl SybrSelect™ (ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA), 0,5 μM pro Primer, 1 μl Matrizen-DNA und 3 μl Wasser in PCR-Qualität. Proben und Mastermix wurden mit epMotion 5075 Liquid Handling Workstations (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) auf Hard-Shell-PCR-Platten mit 384 Vertiefungen geladen. Die Amplifikationsspezifität wurde mittels Schmelzkurvenanalyse bestätigt. Quantifizierungszykluswerte wurden von CFX Manager 3.1 generiert. Standardkurven von sxtA4- und rRNA-Genen im Vergleich zum Quantifizierungszyklus (Cq) wurden unter Verwendung einer zehnfachen Reihenverdünnung von Gblocks®-Fragmenten (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, USA) entwickelt. Die Kopienzahl pro µL DNA wurde anhand der Formel bestimmt:

Standardkurven, Positivkontrollen und Negativkontrollen waren in jeder Probenplatte als Proben-DNA enthalten, die aus Alexandrium-Stämmen bekannter Konzentration (Zellen µL−1) extrahiert wurde. Kopien von sxtA4- und rRNA-Genen pro µL−1 DNA wurden relativ zu qPCR-Standardkurven bestimmt.

Die Bedeutung der Beziehungen zwischen Genomgröße, rRNA-Genkopien Zelle-1, sxtA4-Kopien Zelle-1 und Gesamt-PST-Zelle-1 wurde unter Verwendung der Spearman-Rangkorrelation und der linearen Regression nach Transformation, sofern angemessen, wie in GraphPad Prism 7.04 implementiert, bewertet. Shapiro-Wilk-Tests wurden verwendet, um Normalverteilungen oder logarithmische Normalverteilungen zu untersuchen. Muster der Genomgröße und des mit der Zellkultur verbundenen rRNA-Gen-CNV basierten auf Isolierungsdaten, die von Kultursammlungen und Isolatoren bereitgestellt wurden. Die Tage vom Isolierungsdatum bis zum Probenentnahmedatum wurden berechnet. Um unterschiedliche Laborwachstumsraten zu berücksichtigen, wurden die Kultivierungstage auf der Grundlage veröffentlichter Wachstumsraten für jede Art unter Kulturerhaltungsbedingungen (50–80 μmol PAR; 12:12 L:D-Zyklus, 18–20 °C) in geschätzte Generationenzahlen umgerechnet. Die individuelle Stammvarianz vom Mittelwert der jeweiligen Spezies wurde für die Genomgröße (pg) und das log10-rRNA-Gen (Kopien Zelle-1) berechnet. Die Abweichung der einzelnen Stämme vom Mittelwert der Art wurde unter Verwendung von ([(Xi - X̅)/σ)] berechnet. Die Auswirkung längerer Kulturperioden auf die Variabilität der Genomgröße und des rRNA-Gen-GCN wurde mithilfe des Levene-Tests auf gleiche Varianzen zwischen den folgenden drei Probengruppen untersucht: (1) Mindarie-Isolate, die über <20 Generationen kultiviert wurden; (2) Stämme, die seit 100–800 Generationen kultiviert wurden; (3) Stämme, die seit >1000 Generationen kultiviert werden.

Zellpellets wurden gefriergetrocknet, dann auf PSTs extrahiert und gemessen [53]. Kurz gesagt, die Proben wurden in 2 ml 1 mM Essigsäure resuspendiert und 90 Sekunden lang bei 100 °C für 5 Minuten gevortext, 5 Minuten lang beschallt und mit einem 0,45 µm PVDF-Filter (Merck Millipore, Massachusetts, USA) filtriert. Die chromatographische Trennung (modifiziert [57]) wurde auf einem Thermo Scientific™ ACCELA™ UPLC-System durchgeführt, das an ein Thermo Scientific™ Q Exactive™ (ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA) Massenspektrometer gekoppelt war. Die Analyse wurde mit einer Acquity UPLC BEH Amide 130 A 1,7 µm 150 × 2,1 mm Säule mit einem Injektionsvolumen von 5 µL durchgeführt. Mobile Phasen waren A1 (Wasser/Ameisensäure/NH4OH bei 500:0,075:0,3 v/v/v), B1 (Acetonitril/Wasser/Ameisensäure bei 700:300:0,1 v/v/v). Zertifizierte Standardlösungen von C1, C2, GTX1, GTX2, GTX3, GTX4, GTX5, dcGTX2, dcGTX3, STX, dcSTX, NEO und dcNEO wurden vom National Research Council of Canada (NRC, Halifax, Kanada) erworben. Die Nachweisgrenze der PST-Analysemethode lag für alle Zielverbindungen bei 0,01 pg Zelle−1.

Die Genomgrößen aller Arten waren groß und variierten stark zwischen den Arten, von 22,5 ± 0,3 pg Zelle-1 bis 130,9 ± 1,3 pg Zelle-1 (Abb. 1). Das Genom von A. minutum war am kleinsten (27,0 ± 2,0 pg Zelle, n = 16), während Arten des A. tamarense-Artenkomplexes viel größer waren: A. catenella (79,2 ± 5,9 pg Zelle, n = 13). ), A. pacificum (72,5 ± 14 pg Zelle−1, n = 27) und A. australiense (87,3 ± 8,2 pg Zelle−1, n = 5). Stämme von A. pacificum zeigten eine mehr als dreifache Variation der Genomgröße (42,4 ± 1,5 pg Zelle–1 bis 130,9 ± 1,3 pg Zelle–1) (Abb. 1). Die Genomgröße unter A. pacificum-Stämmen derselben Population variierte um 13 % über und 9 % unter dem Populationsmittelwert (CV = 5,1 %, Abb. 1). A. pacificum-Genome aus verschiedenen Populationen, verschiedenen globalen Regionen und die Zeit in der Laborkultur variierten über einen größeren Bereich (CV = 29,5 %, Abb. 1), es gab jedoch keinen klaren Zusammenhang zwischen der Genomgröße und der Zeit in der Laborkultur oder signifikante Zunahme oder Abnahme der Variabilität der Genomgröße im Laufe der Zeit in Kultur (Abb. 2a, ergänzende Abb. 1A, F = 2,331, df = 2, p = 0,110).

Bilder zeigen Zellen mittels Fluoreszenzlichtmikroskopie, gefärbt mit Calcofluor-Weiß, aus [83, 84].

a Variation in der Genomgröße von Alexandrium spp. über Generationen hinweg in Laborkultur. Die Werte sind Standardabweichungen von der mittleren Genomgröße. Eine dunklere Hintergrundschattierung zeigt den Abweichungsbereich zwischen Mindarie (WA) Alexandrium pacificum-Stämmen an, die vor der Analyse <20 Generationen lang kultiviert wurden. b Variation der rRNA-Kopienzahl der Alexandrium-Arten mit zunehmender Generation in Laborkultur. Die Werte sind Standardabweichungen von der mittleren rRNA-Kopienzahl jeder Art. Eine dunklere Hintergrundschattierung zeigt den Abweichungsbereich zwischen Mindarie (WA) Alexandrium pacificum-Stämmen an, die vor der Analyse <20 Generationen lang kultiviert wurden.

rRNA-GCN variierte um 6 Größenordnungen über Alexandrium-Arten hinweg, von 267 ± 18,8 Kopien Zelle-1 in einem Stamm von A. minutum (RCC4877) bis 1,23 × 108 ± 85 × 106 Kopien Zelle-1 in einem Stamm von A. australiense ( AT-YC-H) (Abb. 3a). Im Allgemeinen zeigten die Stämme von A. australiense und A. pacificum das größte rRNA-GCN, während die Stämme von A. minutum die kleinsten und einheitlichsten waren (Abb. 3a). Die CNV der rRNA-Gene innerhalb der Spezies war überraschend hoch, insbesondere bei Isolaten von A. pacificum, die zwischen 1,74 × 104 ± 1,26 × 103 Kopien Zelle-1 und 1,72 × 107 ± 1,40 × 107 Kopien Zelle-1 und mehr als zwei schwankte Größenordnungen (8,1 × 104 ± 1,40 × 104 Kopien Zelle-1 bis 1,72 × 107 ± 1,41 × 107 Kopien Zelle-1) in einer einzelnen Population (Abb. 4). Erhöhte Generationen in der Laborkultur (Abb. 2b, ergänzende Abb. 1B) hatten keinen Einfluss auf den mittleren rRNA-GCN oder CNV von Alexandrium-Arten (F = 1,819, df = 2, p = 0,177). Die Variabilität war in sxtA4-Kopien über alle Alexandrium-Arten hinweg erkennbar, allerdings in geringerem Umfang als im rRNA-Gen (Abb. 3c, ergänzende Abb. 2). Das sxtA4-GCN von A. pacificum-Stämmen zeigte die größte Variabilität, von 7,8 ± 1,9 Kopien Zelle-1 bis 609 ± 133 Kopien Zelle-1, war jedoch unter Stämmen derselben Population einheitlicher (43,8 ± 9 Kopien Zelle-1 – 609). ± 133 Kopien Zelle-1), während die Variabilität von sxtA4-GCN in den Stämmen A. minutum und A. australiense gering war und bei 0–8,9 ± 0,61 Kopien Zelle-1 lag (Abb. 3c). A. catenella-Stämme variierten zwischen 19,9 ± 10,5 Kopien Zelle-1 und 189,12 ± 58,5 Kopien Zelle-1 (Abb. 3c). Eine signifikante positive Beziehung zwischen den log10-rRNA-Kopien Zelle-1 und der Genomgröße war für alle Alexandrium-Arten erkennbar (Abb. 3b, F = 22,99, df = 49, p < 0,0001, r2 = 0,319), auf Artenebene war dies jedoch der Fall nur innerhalb von A. pacificum signifikant (F = 6,7, df=18, p = 0,0185, r2 = 0,27). In der Beziehung zwischen log10 sxtA4-Kopien Zelle-1 und Genomgröße wurde eine deutlich von Null verschiedene Steigung gefunden, die jedoch nur einen sehr geringen Betrag der Varianz erklärt (ergänzende Abbildung 2A, F = 5,3, df = 43, p = 0,026, r2). = 0,109).

ein CNV von rRNA (±SD) in Stämmen von Alexandrium spp. b Beziehung zwischen Genomgröße (pg Zelle−1) und rRNA-Kopien Zelle−1 in Alexandrium-Arten (F = 22,99, df=49, p < 0,0001, r2 = 0,319). c CNV von sxtA4 (±SD) in Alexandrium-Arten. d Beziehung zwischen den gesamten PSTs (ng Zelle-1) und den sxtA4-Kopien Zelle-1 in Alexandrium-Arten (F = 11,73, df=18, p = 0,003, r2 = 0,395).

a Standorte, an denen Stämme von A. pacificum aus der pazifischen Region isoliert wurden, einschließlich Standorten in ganz Australien. b Mindarie, wo Stämme von A. pacificum isoliert wurden. c CNV von sxtA4 (±SD) und rRNA (±SD) in Alexandrium pacificum von allen Standorten und nur von Mindarie.

Alle Stämme produzierten PSTs mit Ausnahme von A. australiense ATCJ33 und zwei Stämmen von A. minutum, RC4874 und CCMI1002. Das Spektrum der produzierten PST-Kongenere variierte erheblich zwischen und innerhalb der Arten (Abb. 5). Arten von A. catenella enthielten den höchsten PST-Gehalt (Abb. 5, 3d), dominiert von C1, 2 und GTX1, GTX2, GTX3 und GTX4. Sowohl GTX5, GTX6 als auch decarboxylierte Versionen von STX und NeoSTX fehlten größtenteils. Im Gegensatz dazu produzierten A. minutum-Stämme eine eingeschränktere Auswahl an PSTs, wobei C2, GTX2 und GTX3 produziert wurden (Abb. 5). Die gesamten PSTs waren bei A. pacificum einheitlicher, es gab keine durchgehend dominanten PST-Varianten. Eine positive Beziehung war signifikant zwischen log10 sxtA4-Kopien Zelle-1 und log10 Gesamt-PSTs ng Zelle-1 (Abb. 3d, F = 11,73, df = 18, p = 0,003, r2 = 0,395). A. minutum produzierte im Vergleich zu A. pacificum eine höhere Menge an PST pro Kopie von sxtA4. Stämme von A. australiense mit extrem niedrigen oder keinen nachweisbaren PSTs (ATCJ33, AADVN1, AT-YC-H), durchschnittlich <1 sxtA4-Kopienzelle−1. In Fällen, in denen weniger als eine sxtA4-Kopie Zelle-1 gefunden wurde, war dies auf Kopienzahlen zurückzuführen, die unter dem Quantifizierungsniveau des qPCR-Assays lagen.

Die Heatmap zeigt die Variationen zwischen den Arten und innerhalb der Arten der Konzentration jedes PST-Kongeners in Alexandrium spp.

Genomisches CNV in Eukaryoten, Bakterien und Archaeen wurde zunehmend dokumentiert, manchmal im Zusammenhang mit der Duplikation oder Polyploidie des gesamten Genoms [1,2,3,4,5]. CNV gilt als wichtiger evolutionärer Prozess, der die Expression wichtiger phänotypischer Merkmale beeinflusst [1, 2, 4,5,6,7]. Das Vorhandensein von CNV ist auch von praktischer Bedeutung und beeinflusst die Art und Weise, wie molekulare Barcode-Gene wie rRNA, die häufig für Gemeinschaftsstrukturanalysen verwendet werden, interpretiert werden können. Die Konsistenz von GCN ist bei mikrobiellen Eukaryoten kaum bekannt und die Ursachen und Folgen von CNV auf genomischer Ebene [2, 4, 5] wurden selten untersucht.

Schätzungen des CNV in anderen marinen mikrobiellen Eukaryoten deuteten darauf hin, dass die Variation von 1–3 Größenordnungen in der rRNA, wie sie in Foraminiferen, Ciliaten, Haptophyten, Pilzen und Kieselalgen gefunden wurde, als sehr hoch angesehen wurde [10,11,12], was aber nicht der Fall war immer im Zusammenhang mit der Zell- oder Genomgröße [10, 58]. In dieser Studie wurde festgestellt, dass rRNA-CNV in einer Gattung einer häufig vorkommenden Schadalge (Alexandrium spp.) etwa sechs Größenordnungen umfasst. Dies sollte als minimale Variation betrachtet werden, da wir vergleichsweise wenige Arten dieser Gattung untersucht haben. Frühere Schätzungen der genomischen rRNA in Alexandrium spp. ergaben 102–103 Kopien Zelle-1 in A. minutum, [16]; von 104–106 Kopien Zelle-1 in A. pacificum [9] und A. catenella [17, 44, 45], im Einklang mit unserer Studie. Sehr hohe rRNA-GCN-Werte (106) sind auch von anderen Gonyaulacales spp. bekannt [59, 60], gemessen mit Techniken wie digitaler qPCR. Die Arten von Alexandrium reichen daher von den niedrigsten bis zu den höchsten genomischen rRNA-Kopien Zelle-1 von Dinoflagellaten (Abb. 6a). In unserer Studie wurde vor allem ein erheblicher intraspezifischer CNV von bis zu zwei Größenordnungen bei Personen gefunden, die aus derselben Population stammten (Abb. 4). Kürzlich wurde über CNV von etwa einer Größenordnung bei 14 Stämmen des Haptophyten Emiliania huxleyi aus verschiedenen globalen Standorten berichtet [10]. Mittels Einzelzell-qPCR wurde innerhalb einer Foraminiferenart ein Unterschied von zwei Größenordnungen in den rRNA-Genkopien festgestellt [12]. Unsere Ergebnisse und diese jüngsten Studien deuten darauf hin, dass intraspezifisches rRNA-CNV in marinen mikrobiellen Eukaryoten häufig vorkommt, was darauf hindeutet, dass rRNA-Gene, die Zelle-1 mehrerer Stämme kopieren, erforderlich sind, um einigermaßen repräsentative GCN-Bereiche zu bestimmen. Während sich CNV wahrscheinlich auf Analysen aller marinen mikrobiellen Eukaryoten auswirkt, wird es sich bei Nichtberücksichtigung dieses Problems insbesondere auf von Dinoflagellaten dominierte Ansammlungen auswirken, und die Annahme einer Ähnlichkeit der GCN in Bezug auf den Grad der phylogenetischen Verwandtschaft scheint unwirksam zu sein.

a Zusammenhang zwischen log10-Genomgröße (pg Zelle−1) und log10-rRNA-Kopien Zelle−1 in Dinoflagellaten aus der aktuellen Studie und früherer Literatur (F = 44,2, df=74, p < 0,0001, r2 = 0,374). Regressionslinie und 95 %-Konfidenzintervall angezeigt. Lila Kreise = Suessiales spp, rote Kreise = Gymnodiniales spp, grüne Kreise = Prorocentrales spp, orange Kreise = Peridiniales spp, blaue Kreise = Gonyaulacales spp, gelbe Kreise = Dinophysiales spp. Schwarze Dreiecke = Daten aus der vorliegenden Studie. b Beziehung zwischen log10-Zellvolumen (µm3) und log10-rRNA-Kopien Zelle-1 in Dinoflagellaten, aus der vorliegenden und früheren Studien (F = 0,26,59, df=106, p < 0,0001, r2 = 0,200). c Beziehung zwischen log10-Zellvolumen (µm3) und log10-rRNA-Kopien Zelle-1 in Dinoflagellaten, nur aus veröffentlichten Studien (F = 16,4, df=58, p = 0,0002, r2 = 0,2204). [Daten aus: 9, 10, 13, 19, 30, 38, 54, 55, 62, 63, 71, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81].

Unterschiede im GCN können das Ergebnis von Prozessen im Genommaßstab sein, einschließlich Polyploidie, sowie von Prozessen, die sich auf Teile des Genoms auswirken, wie Aneuploidie, Chromosomenduplikationen, Fehler bei der homologen Rekombination und Retroposition (27, 31, 32). Mutationen und Selektionen in Laborkulturen könnten zu CNV führen, möglicherweise mit funktionellen Auswirkungen, wie bei Bakterien und Pilzen berichtet wurde, und spezifische Prozesse können sich insbesondere auf rRNA-Loci auswirken [3, 61]. In rRNA-Genen führen das Vorhandensein von Tandem-Wiederholungen, die stark transkribiert werden, und die Schwierigkeit, repetitive Sequenzen zu replizieren, dazu, dass rDNA von Natur aus weniger stabil ist als andere Gene und anfällig für CNV [47]. Über Zyklen der Zellteilung hinweg zeigte rRNA-GCN in Hefe und Bakterien in Kultur ein Muster der Reduktion von Pilzen durch rekombinationsbedingten Verlust [62,63,64]. Neben diesen inhärenten genetischen Faktoren können Umweltfaktoren bei einigen Mikroben zu einer induzierten CNV in rRNA-Genen führen [58, 61, 64, 65]. Bei den Ciliaten Entodinium, Epidinium und Ophryoscolex verändert sich der GCN der rRNA als Reaktion auf die Nährstoffverfügbarkeit in Kulturen [65]. Höherer rRNA-GCN hat ökologische Auswirkungen, bietet Schutz vor Mutagenen (62, 63) und wirkt sich auf Wachstum und Wettbewerbsfähigkeit aus (58, 65).

Wir untersuchten CNV in Bezug auf Generationen in Kulturen und geografischen Regionen der Isolation. Unsere Stämme erstreckten sich über Zeiträume in Kultur von mehreren Monaten bis etwa 30 Jahren, es wurden jedoch keine signifikanten Auswirkungen auf die Variabilität der Genomgröße oder den rRNA-CNV (Abb. 2, ergänzende Abb. 1), die intraspezifische genetische Diversität in rRNA-Genkopien in A., festgestellt. pacificum-Isolate von voneinander entfernten Standorten waren in natürlichen Populationen größer als die Menge, die durch bis zu 30 Jahre lange Laborselektion induziert wurde (Abb. 4). Die Quelle eines solchen CNV kann eine Retroposition sein, wie sie bei Dinoflagellaten häufig vorkommt [21, 27, 31], und es wurde festgestellt, dass sie die Quelle mehrerer PCNA-Kopien bei Dinoflagellaten ist [66], da Sequenzen Reste von Dinoflagellaten spezifisch aufwiesen gespleißte Leadersequenzen, die der mRNA hinzugefügt werden, sind ein Beweis für die umgekehrte Transkription in das Genom. Bei Symbiodiniaceae können Chromosomen im Zusammenhang mit bestimmten biologischen Prozessen angereichert werden, was darauf hindeutet, dass Chromosomen je nach Bedarf dupliziert werden oder verloren gehen können, wodurch CNV entsteht [28,29,30]. Unabhängig davon, ob es sich um einen für rRNA, Retroposition und/oder Chromosomenduplikationen spezifischen Prozess handelt, scheint CNV unseren Daten zufolge über lange evolutionäre Zeitskalen aufzutreten, da Dinoflagellaten-Mutationsraten auf einer dekadischen Zeitskala kein wesentlicher Faktor für die hohe CNV waren.

Es wurde berechnet, dass <0,1 % der Arten, für die Daten zur Genomgröße verfügbar sind, Genome von mehr als 100 GB haben [24], was die außergewöhnlich großen Genome von Dinoflagellaten hervorhebt [21, 22, 24, 28, 29, 30]. Bei Eukaryoten gibt es keine Korrelation zwischen der Genomgröße und den kodierenden Sequenzen in Genomen, die größer als 0,01 Gb sind, was als C-Wert-Rätsel bekannt ist [21, 26, 67]. Alexandrium-Arten befanden sich in der mittleren bis oberen Hälfte der gemeldeten Dinoflagellaten-Genomgrößen (Abb. 1, ergänzende Abb. 2B), was auf eine Expansion während der Evolution hinweist. Die durch den Zellzyklus synchronisierten Genomgrößen von A. pacificum variierten um das Dreifache (Abb. 1) und waren damit größer als der bereits große Bereich in früheren Berichten über Stämme dieser Art (60–104 pg Zelle−1) [9, 22, 40, 68 , 69]. Spezialisierte „ribosomale Chromosomen“ wurden im ehemaligen Alexandrium tamarense-Artenkomplex gefunden, einschließlich A. pacificum, aber nicht in A. minutum, [68], das in unserer Studie und früheren Studien viel konsistentere Genomgrößen unter Isolaten zeigte (22–29 pg). Zelle-1 in früheren Studien, wie in dieser Studie [39, 40]). Eine signifikante Beziehung zwischen der Genomgröße und den rRNA-Genkopien-1-Zellen in A. pacificum (Abb. 6a) könnte darauf hindeuten, dass die Duplikation der rRNA-Chromosomen zur Vergrößerung der Genomgröße bei dieser Art beiträgt [68], bei den anderen untersuchten Alexandrium-Arten jedoch unwichtig zu sein scheint.

Frühere Studien haben Dinoflagellatengenome mit einer Vielzahl von Methoden gemessen: Durchflusszytometrie, Färbung mit Propidiumiodid oder anderen DNA-Farbstoffen und unter Verwendung von Zellen von Hühnern oder einem Tiergenom ähnlicher Größe als Standard sowie Schätzungen aus der Genomsequenzierung (d. h. [22 , 28,29,30, 39, 66, 67, 70], Ergänzungstabelle 3). Genomgrößenmessungen auf der Grundlage der Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Standards eines tierischen Genoms, das kleiner ist und sich strukturell von einem Dinoflagellatengenom unterscheidet, können im Vergleich zu Schätzungen sequenzierter Dinoflagellatengenome zu größeren Schätzungen der Genomgröße führen (Ergänzungstabelle 3). Das Muster war jedoch nicht konsistent und einige ähnliche Schätzungen wurden unabhängig von der Methode ermittelt (Ergänzungstabelle 3). Dinoflagellaten haben ungewöhnlich große Genome, weshalb in der Regel keine Standards in der entsprechenden Größe verfügbar sind. Wir haben sichergestellt, dass die bei dieser Messung verwendete Standardkurve eine gute Linearität erreicht, um mögliche Fehler zu minimieren (Ergänzungsmaterialien).

Angesichts der Allgegenwart mikrobieller eukaryotischer ökologischer Analysen, die routinemäßig auf rRNA-Gene für qPCR und Meta-Barcoding abzielen, kann es den Anschein haben, als seien solche Ansätze sehr gut charakterisiert [9, 10, 13, 17, 20, 56, 59, 71]. Erhebliche und gerechtfertigte Aufmerksamkeit wurde auf Bias-Quellen gerichtet, die universelle rRNA-Genmarker verwechseln, insbesondere PCR-Primer-Bias, Sequenzierungs-Bias und statistische Bias [3, 72, 73]. Es wurden Primer entwickelt, die den Primer-Bias angehen [72, 73], statistische Ansätze haben sich mit anderen Bias befasst, allerdings wurde dem GCN-Bias bis vor kurzem weniger Aufmerksamkeit geschenkt [3, 74, 75, 76]. CNV ist besonders besorgniserregend für qPCR-basierte Assays, die zunehmend zum Nachweis von HAB-Arten wie Alexandrium spp. eingesetzt werden [9, 16, 17, 44, 45, 56, 59, 60]. Frühere Schätzungen der Zellhäufigkeit mittels rRNA-gerichteter qPCR von HAB-Arten deuten sowohl auf über- als auch auf unterschätzte Häufigkeiten von bis zu 500 % hin [45, 60, 77]. Trotz der hohen Variabilität des rRNA-GCN innerhalb einer Population und Art (Abb. 4) ist es möglich, ein qPCR-Ergebnis mithilfe detaillierter Lichtmikroskopie oder fluoreszenzmarkierter Durchflusszytometrie mit einer anderen Art von Zellzahl in der Umgebung zu kalibrieren[44, 45, 60]. Ein Stichprobendesign, das den CNV mehrerer in einer Region gleichzeitig vorkommender Populationen integriert, könnte einen lokalen rRNA-GCN als Kalibrierungsproxy bestimmen. Da die Mutationsraten von rRNA-GCN über Jahrzehnte niedrig waren (Abb. 2), ist es bei der Aussaat einer HAB-Art über lokale Zystenbetten möglicherweise nicht erforderlich, bei jeder Probe eine Neukalibrierung durchzuführen, da dies die Einfachheit, Geschwindigkeit und Skalierbarkeit beeinträchtigen würde qPCR-basierte Quantifizierung veraltet.

Die Erstellung von Community-Profilen mittels molekularer Barcodes stellt bei der Berücksichtigung von CNV eine möglicherweise schwierigere Herausforderung dar als qPCR, da die Variabilität zwischen Taxa unbekannt ist und Informationen zu GCN fehlen. GCN-Korrekturfaktoren sind eine Option zur Behebung dieses Problems und können in Barcode-Analysen integriert werden [11, 74,75,76]. Allerdings sind die GCN-Daten sehr begrenzt und uneinheitlich verteilt. Aktuelle Korrekturansätze basieren auf Vorhersagen unter Verwendung phylogenetisch verwandter Taxa (65). GCN von bakterieller und pilzlicher rRNA ist jedoch nur mäßig phylogenetisch konserviert (58, 65, 74), was zu zunehmend ungenauen GCN-Vorhersagen für divergierende Abstammungslinien führt (65). Die erste Studie, die versuchte, einen GCN-Korrekturfaktor für marine mikrobielle rRNA-Gene anzuwenden, verwendete einen einzelnen mittleren GCN-Zelle-1-Wert für jede Klasse aus einer Datenbank mit etwa 60 Arten, 4919 Zell-1-Kopien für Dinoflagellaten und 166 Zell-1-Kopien für Kieselalgen und 71.710 Kopien Zelle-1 für Ciliaten [77]. Obwohl dies eine Verbesserung gegenüber der Verwendung von GCN als direktem Indikator für die ASV-Häufigkeit darstellt, zeigt der in unserer Studie festgestellte Grad der Variabilität, dass ein solcher Ansatz begrenzt ist. Genomgrößen, möglicherweise ein Proxy für GCN [Abb. 6a], sind variabel und für die meisten Dinoflagellaten unbekannt, sodass dieser Ansatz ebenfalls nicht durchführbar erscheint. [65] halten bioinformatisch basierte Lösungen für die CNV von rRNA-Genen für nicht realistisch für mikrobielle Eukaryoten, und basierend auf unseren aktuellen Daten stimmen wir dieser Position zu.

Die Metabarkodierung mikrobieller Eukaryoten wird als semiquantitativ bezeichnet, da vermutet wird, dass die relative Häufigkeit der Taxa proportional repräsentativ für die Gemeinschaft sein könnte [20]. Analysen der Verzerrung bei der Metabarkodierung von Dinoflagellaten-Mock-Gemeinschaften unter Verwendung mehrerer Primer, die auf rRNA-Gene abzielten, oder Vergleiche mit mikroskopischen Zählungen ergaben jedoch, dass die ASV-Häufigkeiten stark verzerrt waren [78, 79]. Es wurde argumentiert, dass eine fehlende Korrelation zwischen Zellzahl und rRNA-Genen unwichtig sei, da die Kopien von Zelle-1 des rRNA-Gens mit dem Zellvolumen [13, 19, 20, 69] in marinen Eukaryoten korrelieren, was einen stärkeren Hinweis auf die Funktion des Ökosystems liefert als die Zellhäufigkeit. Wir fanden jedoch nur eine schwache Beziehung zwischen den rRNA-Genkopien Zelle-1 und dem Zellvolumen in Dinoflagellaten, was nur 20 % der Varianz erklärt (Abb. 6b, F = 0,26,59, df = 106, p < 0,0001, r2 = 0,200). ). Dies war unabhängig von unserer vorliegenden Studie, denn selbst als wir veröffentlichte Daten zur rRNA-Genkopie, zum Zellvolumen und zur Genomgröße analysierten [9, 10, 16, 19, 22, 40, 59, 60, 67, 68, 69, 70, 80,81,82,83,84,85] fanden wir 22 % der Varianz erklärt (Abb. 6c, F = 16,4, df=58, p = 0,0002, r2 = 0,2204). Bei der Analyse nur der rRNA-Kopien Zelle-1 im Verhältnis zum Zellvolumen für Gonyaulacales spp, der Ordnung, die viele der wichtigsten HAB-Taxa umfasst, fanden wir keine signifikante Beziehung (Abb. 6c, ergänzende Abb. 2, F = 3,26, df = 85). , p=ns, r2 = 0,037). Dies kann auf hohe Evolutionsraten von rRNA-Genen in dieser Reihenfolge hinweisen, die im Zusammenhang mit langen Verzweigungslängen in rRNA-Gen-basierten Phylogenien festgestellt wurden (86). Dinoflagellaten mit den kleinsten Genomen, wie Suessiales spp., scheinen einen einfacheren Zusammenhang zwischen Genomgröße, Zellvolumen und GCN zu zeigen (Abb. 6a–c), aber Polyploidie und Chromosomenduplikation sind von diesen Taxa immer noch bekannt [85].

Angesichts der Tatsache, dass die Ökosystemfunktion im Allgemeinen von vorrangigem Interesse in der mikrobiellen ökologischen Forschung ist, schlagen wir vor, Metabarcoding als Maß für das Vorhandensein/Abwesenheit von Diversität zu betrachten und funktionelle Gene mithilfe von Metagenomik oder genspezifischen Tests in Bezug auf interessierende Merkmale zu quantifizieren. Unsere Daten deuten darauf hin, dass in PST-produzierenden Stämmen (2–102 Kopien Zelle-1) in Alexandrium vergleichsweise weniger Kopien des mit der PST-Synthese verbundenen Gens sxtA4 vorhanden waren, mit einem kleineren CNV-Bereich (Abb. 3c), was mit übereinstimmt Studien von sxtA4 in A. minutum (1,5–46 Kopien Zelle-1; [39, 40]) und A. pacificum (34–200 Kopien Zelle-1; [37, 40, 44]). Sowohl die reduzierte CNV als auch die signifikante Korrelation von sxtA4-GCN mit PSTs Zelle-1 weisen darauf hin, dass sxtA4 ein informatives Ziel für das Potenzial für die PST-Produktion in situ ist. Wir fanden eine Vielzahl von PST-Analoga, die von Alexandrium-Arten produziert werden, wobei einige Arten wie A. catenella konsistentere Analoga produzieren als andere (Abb. 5). sxtA ist an der Synthese der Ausgangsverbindung Saxitoxin beteiligt [36, 37] und maßgeschneiderte Enzyme im sxt-Cluster scheinen für Analoga verantwortlich zu sein, was darauf hindeutet, dass diese Gene in Zukunft quantifiziert werden könnten. Ein Vorteil des sxtA-Nachweises besteht darin, dass die Dynamik des Nahrungsnetzes untersucht werden kann, beispielsweise durch Quantifizierung der sxtA-Aufnahme in Wirbellosen oder Protisten [87]. Beispiele für ähnliche funktionelle Gene, die in situ nachgewiesen wurden oder werden könnten, sind zellzyklusbezogene Gene wie pcna, die an der Proliferation und dem Wachstum von HAB-Spezies beteiligt sind [66], Transporter, Rezeptoren, Gene, die an der N- und P-Aufnahme und anderen Stoffwechselfunktionen beteiligt sind [ 13, 21, 29, 30, 85]. Angesichts des Potenzials solcher Gene, bei Dinoflagellaten eine Dosisreaktion zu zeigen, könnte dies auf einen vielversprechenden Ansatz für die Gemeinschaftsökologie in von Dinoflagellaten dominierten Ökosystemen hinweisen.

Wir haben eine rRNA-Gen-CNV von bis zu 6 Größenordnungen bei Dinoflagellaten auf Klassen-, Gattungs- und Artenebene und ihre Beziehung zur Genomgröße gezeigt, jedoch nicht zu Generationen in Laborkulturen und sehr schwach mit dem Zellvolumen. Berichtete signifikante Korrelationen zwischen Zellvolumen und genomischen rRNA-Kopien in marinen mikrobiellen Eukaryoten wurden wahrscheinlich durch Taxa mit einer einfacheren Genomorganisation verursacht und nicht durch Dinoflagellaten, Ciliaten und Foraminiferen, die zusammengenommen den Großteil des 18 S-rRNA-Signals ausmachen können. Wir zeigen einen signifikanten Dosierungseffekt eines funktionellen Gens im Zusammenhang mit einem häufigen HAB-Toxin und schlagen vor, dass solche funktionellen Gene mit geringer Kopienzahl stabilere und aussagekräftigere Ziele für die ökologische Profilierung eukaryotischer Mikroben sind, wobei funktionsbasierte Methoden wie Metagenomik und spezifische merkmalsbasierte Methoden zum Einsatz kommen Molekulare Tests.

Die Daten werden für alle nichtkommerziellen Zwecke zur Verfügung gestellt.

Hardigan MA, Crisovan E, Hamilton JP, Kim J, Laimbeer P, Leisner CP, et al. Die Genomreduktion deckt eine große entbehrliche Genom- und Anpassungsrolle für die Variation der Kopienzahl in aexuell besiedeltem Solanum tuberosum auf. Pflanzenzelle. 2016;28:388–405.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Perry GH, Dominy NJ, Claw KG, Lee AS, Fiegler H, Redon R, et al. Ernährung und die Entwicklung der Variation der Kopienzahl des menschlichen Amylase-Gens. Nat Genet. 2007;39:1256–60.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Soppa J. Polyploidie und Gemeinschaftsstruktur. Nat Microbiol. 2017;2:16261.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Conrad DF, Pinto D, Redon R, Feuk L, Gokcumen O, Zhang Y, et al. Ursprünge und funktionelle Auswirkungen der Variation der Kopienzahl im menschlichen Genom. Natur. 2010;464:704–12.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zerulla K, Soppa J. Polyploidie bei Haloarchaea: Vorteile für Wachstum und Überleben. Vordere Mikrobiol. 2014;5:274.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Iantorno SA, Durrant C, Khan A, Sanders MJ, Beverley SM, Warren WC, et al. Die Genexpression bei Leishmanien wird überwiegend durch die Gendosis reguliert. mBio. 2017;8:e01393-17.

Artikel Google Scholar

Gillard GB, Gronvold L, Rosaeg LL, Holen MM, Monsen O, Koop BF, et al. Die vergleichende Regulomik unterstützt die umfassende Selektion der Gendosis nach der Duplikation des gesamten Genoms. Genombiol. 2021;22:103.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Keeling PJ, Campo JD. Meeresprotisten sind nicht nur große Bakterien. Curr Biol. 2017;27:R541–R549.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Galluzzi L, Bertozzini E, Penna A, Perini F, Garcés E, Magnani M. Analyse des rRNA-Gengehalts in den mediterranen Dinoflagellaten Alexandrium catenella und Alexandrium taylori: Auswirkungen auf die quantitativen Echtzeit-PCR-basierten Überwachungsmethoden. J Appl Phycol. 2010;22:1–9.

Artikel CAS Google Scholar

Gong W, Marchetti A. Schätzung der 18S-Genkopienzahl in marinem eukaryotischem Plankton mithilfe eines Sequenzierungsansatzes der nächsten Generation. Front Marine Sci. 2019;6:219.

Artikel Google Scholar

Wang C, Zhang T, Wang Y, Katz LA, Gao F, Song W. Entwirrung von Variationsquellen in SSU-rDNA-Sequenzen aus Einzelzellanalysen von Ciliaten: Auswirkungen der Variation der Kopienzahl und experimenteller Fehler. Proc Biol Sci. 2017;284:20170425.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Milivojevic T, Rahman SN, Raposo D, Siccha M, Kucera M, Morard R. Hohe Variabilität in der Kopienzahl des SSU-rDNA-Gens unter planktonischen Foraminiferen, nachgewiesen durch Einzelzell-qPCR. ISME-Komm. 2021;1:63.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

de Vargas C, Audic S, Henry N, Decelle J, Mahé F, Logares R, et al. Meeresplankton. Eukaryotische Planktonvielfalt im sonnenbeschienenen Ozean. Wissenschaft. 2015;348:1261605.

Artikel PubMed Google Scholar

Thornhill DJ, Lajeunesse TC, Santos SR. Messung der rDNA-Diversität in eukaryontischen mikrobiellen Systemen: Wie intragenomische Variation, Pseudogene und PCR-Artefakte die Schätzungen der Biodiversität verfälschen. Mol Ecol. 2007;16:5326–40.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Egge E, Bittner L, Andersen T, Audic S, de Vargas C, Edvardsen B. 454 Pyrosequenzierung zur Beschreibung der Zusammensetzung, Diversität und relativen Häufigkeit mikrobieller eukaryontischer Gemeinschaften: ein Test für marine Haptophyten. Plus eins. 2013;8:e74371.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Galluzzi L, Penna A, Bertozzini E, Vila M, Garces E, Magnani M. Entwicklung eines Echtzeit-PCR-Assays für den schnellen Nachweis und die Quantifizierung von Alexandrium minutum (einem Dinoflagellaten). Appl Environ Microbiol. 2004;70:1199–206.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Erdner DL, Percy L, Keafer B, Lewis J, Anderson DM. Ein quantitativer Echtzeit-PCR-Assay zur Identifizierung und Zählung von Alexandrium-Zysten in Meeressedimenten. Deep Sea Res Teil 2 Top Stud Oceanogr. 2010;57:279–87.

Artikel CAS PubMed Central Google Scholar

Prokopowich CD, Gregory TR, Crease TJ. Die Korrelation zwischen der rDNA-Kopienzahl und der Genomgröße in Eukaryoten. Genom. 2003;46:48–50.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Godhe A, Asplund ME, Harnstrom K, Saravanan V, Tyagi A, Karunasagar I. Quantifizierung von Diatomeen- und Dinoflagellaten-Biomassen in Meereswasserproben an der Küste durch Echtzeit-PCR. Appl Environ Microbiol. 2008;74:7174–82.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Le Bescot N, Mahé F, Audic S, Dimier C, Garet MJ, Poulain J, et al. Globale Muster der pelagischen Dinoflagellaten-Diversität in den Größenklassen der Protisten, enthüllt durch Metabarcoding. Umwelt Mikrobiol. 2016;18:609–26.

Artikel PubMed Google Scholar

Lin S. Genomisches Verständnis von Dinoflagellaten. Res Mikrobiol. 2011;162:551–69.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

LaJeunesse TC, Lambert G, Andersen RA, Coffroth MA, Galbraith DW. Die Genomgrößen (DNA-Gehalt) von Symbiodinium (Pyrrhophyta) sind unter den Dinoflagellaten am kleinsten. J Phycol. 2005;41:880–6.

Artikel CAS Google Scholar

Hackett JD, Scheetz TE, Yoon HS, Soares MB, Bonaldo MF, Casavant TL, et al. Einblicke in ein Dinoflagellaten-Genom durch Analyse exprimierter Sequenz-Tags. BMC-Genomik. 2005;6:80.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hidalgo O, Pellicer J, Christenhusz M, Schneider H, Leitch AR, Leitch IJ. Gibt es eine Obergrenze für die Genomgröße? Trends Pflanzenwissenschaft. 2017;22:567–73.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pellicer J, Hidalgo O, Dodsworth S, Leitch IJ. Genomgrößenvielfalt und ihr Einfluss auf die Evolution von Landpflanzen. Gene (Basel). 2018;9:88.

Artikel PubMed Google Scholar

Murray SA, Suggett DJ, Doblin MA, Kohli GS, Seymour JR, Fabris M, et al. Entschlüsselung der funktionellen Genetik von Dinoflagellaten: ein Überblick über Ansätze und Möglichkeiten. Perspektive Phycol. 2016;3:37–52.

Google Scholar

Bachvaroff TR, Place AR. Von Anfang bis Ende: Tandem-Genanordnung, Kopienzahl und Transspleißstellen im Dinoflagellaten Amphidinium carterae. Plus eins. 2008;3:e2929.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu H, Stephens TG, Gonzalez-Pech RA, Beltran VH, Lapeyre B, Bongaerts P, et al. Symbiodinium-Genome zeigen eine adaptive Evolution von Funktionen im Zusammenhang mit der Korallen-Dinoflagellaten-Symbiose. Kommunale Biol. 2018;1:95.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin S, Cheng S, Song B, Zhong X, Lin X, Li W, et al. Das Genom von Symbiodinium kawagutii beleuchtet die Genexpression von Dinoflagellaten und die Korallensymbiose. Wissenschaft. 2015;350:691–4.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Stephens TG, Gonzalez-Pech RA, Cheng Y, Mohamed AR, Burt DW, Bhattacharya D, et al. Die Genome des Dinoflagellaten Polarella glacialis kodieren tandemartig wiederholte Single-Exon-Gene mit adaptiven Funktionen. BMC Biol. 2020;18:56.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Slamovits CH, Keeling PJ. Weit verbreitetes Recycling verarbeiteter cDNAs in Dinoflagellaten. Curr Biol. 2008;18:R550–2.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Song B, Chen S, Chen W. Dinoflagellaten, eine einzigartige Linie für die Retrogenforschung. Vordere Mikrobiol. 2018;9:1556.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Goetz EJ, Greco M, Rappaport HB, Weiner AKM, Walker LM, Bowser S, et al. Foraminiferen als Modell für die umfangreiche Variabilität der Genomdynamik bei Eukaryoten. Bioessays. 2022;44:e2100267.

Artikel PubMed Google Scholar

Kouakou CRC, Poder TG. Wirtschaftliche Auswirkungen schädlicher Algenblüten auf die menschliche Gesundheit: eine systematische Übersicht. J Wassergesundheit. 2019;17:499–516.

Artikel PubMed Google Scholar

Ryderheim F, Selander E, Kiorboe T. Die durch Raubtiere verursachte Verteidigung bei einem Dinoflagellaten bringt Vorteile ohne direkte Kosten. ISME J. 2021;15:2107–16.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hackett JD, Wisecaver JH, Brosnahan ML, Kulis DM, Anderson DM, Bhattacharya D, et al. Entwicklung der Saxitoxinsynthese in Cyanobakterien und Dinoflagellaten. Mol Biol Evol. 2013;30:70–8.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Stuken A, Orr RJ, Kellmann R, Murray SA, Neilan BA, Jakobsen KS. Entdeckung kernkodierter Gene für das Neurotoxin Saxitoxin in Dinoflagellaten. Plus eins. 2011;6:e20096.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Orr RJ, Stuken A, Murray SA, Jakobsen KS. Entwicklung und Verteilung der Saxitoxin-Biosynthese in Dinoflagellaten. Mar-Drogen. 2013;11:2814–28.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Stuken A, Riobo P, Franco J, Jakobsen KS, Guillou L, Figueroa RI. Der Gehalt an paralytischem Schalentiertoxin hängt mit der genomischen sxtA4-Kopienzahl in Alexandrium minutum-Stämmen zusammen. Vordere Mikrobiol. 2015;6:404.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Geffroy S, Lechat MM, Le Gac M, Rovillon GA, Marie D, Bigeard E, et al. Vom sxtA4-Gen bis zur Saxitoxinproduktion: Was kontrolliert die Variabilität zwischen Alexandrium minutum- und Alexandrium pacificum-Stämmen? Vordere Mikrobiol. 2021;12:613199.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Savela H, Harju K, Spoof L, Lindehoff E, Meriluoto J, Vehniainen M, et al. Die Menge des Dinoflagellaten-sxtA4-Gens und die Zelldichte korrelieren mit der paralytischen Schalentiertoxinproduktion in Alexandrium ostenfeldii-Blüten. Schädliche Algen. 2016;52:1–10.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Perini F, Galluzzi L, Dell'Aversano C, Iacovo ED, Tartaglione L, Ricci F, et al. SxtA- und sxtG-Genexpression und Toxinproduktion im mediterranen Alexandrium minutum (Dinophyceae). Meeresdrogen. 2014;12:5258–76.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wiese M, Murray SA, Alvin A, Neilan BA. Genexpression und molekulare Evolution von sxtA4 in einem Saxitoxin produzierenden Dinoflagellaten Alexandrium catenella. Toxikon. 2014;92:102–12.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Murray SA, Wiese M, Stuken A, Brett S, Kellmann R, Hallegraeff G, et al. sxtA-basierter quantitativer molekularer Assay zur Identifizierung Saxitoxin-produzierender schädlicher Algenblüten in Meeresgewässern. Appl Environ Microbiol. 2011;77:7050–7.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Murray SA, Ruvindy R, Kohli GS, Anderson DM, Brosnahan ML. Evaluierung von sxtA- und rDNA-qPCR-Assays durch Überwachung einer Küstenblüte von Alexandrium catenella Gruppe 1. Sci Rep. 2019;9:14532.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Murray SA, Diwan R, Orr RJ, Kohli GS, John U. Genduplikation, -verlust und -selektion in der Evolution der Saxitoxin-Biosynthese in Alveolaten. Mol Phylogenet Evol. 2015;92:165–80.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Salim D, Gerton JL. Ribosomale DNA-Instabilität und Genomanpassungsfähigkeit. Chromosomenres. 2019;27:73–87.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Keller MD, Selvin RC, Claus W, Guillard RRL. Medien für die Kultur ozeanischen Ultraphytoplanktons. J Phycol. 1987;23:633–8.

Artikel Google Scholar

Scholin CA, Herzog M, Sogin M, Anderson DM. Identifizierung gruppen- und stammspezifischer genetischer Marker für weltweit verbreitete Alexandrium (Dinophyceae).II. Sequenzanalyse eines Fragments des LSU-rRNA-Gens. J Phycol. 1994;30:999–1011.

Artikel CAS Google Scholar

Nunn GB, Theisen BF, Christensen B, Arctander P. Einfachheitskorreliertes Größenwachstum des nuklearen 28S-ribosomalen RNA-D3-Expansionssegments in der Krustentierordnung Isopoda. J Mol Evol. 1996;42:211–23.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Doblin MA, Blackburn SI, Hallegraeff GM. Wachstums- und Biomassestimulation des giftigen Dinoflagellaten Gymnodinium catenatum (Graham) durch gelöste organische Substanzen. J Exp Mar Bio Ecol. 1999;236:33–47.

Artikel CAS Google Scholar

Taroncher-Oldenburg G, Kulis DM, Anderson DM. Toxinvariabilität während des Zellzyklus des Dinoflagellaten Alexandrium fundyense. Limnol Oceanogr. 1997;42:1178–88.

Artikel CAS Google Scholar

Figueroa RI, Garcés E, Bravo I. Die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Artenidentifizierung und Lebenszyklusstudien bei Dinoflagellaten. Deep Sea Res Teil 2 Top Stud Oceanogr. 2010;57:301–7.

Artikel CAS Google Scholar

Vindelov LL, Christensen IJ, Nissen NI. Standardisierung der hochauflösenden durchflusszytometrischen DNA-Analyse durch die gleichzeitige Verwendung von roten Blutkörperchen von Hühnern und Forellen als interne Referenzstandards. Zytometrie. 1983;3:328–31.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Doležel J, Bartoš J, Voglmayr H, Greilhuber J. Kern-DNA-Gehalt und Genomgröße von Forellen und Menschen. Zytometrie Teil A. 2003;51A:127–8.

Artikel Google Scholar

Ruvindy R, Bolch CJ, MacKenzie L, Smith KF, Murray SA. qPCR-Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung mehrerer paralytischer Schalentiertoxin-produzierender Alexandrium-Arten. Vordere Mikrobiol. 2018;9:3153.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Harwood DT, Boundy M, Selwood AI, van Ginkel R. Verfeinerung und Implementierung der Lawrence-Methode (AOAC 2005.06) in einem kommerziellen Labor: Assay-Leistung während eines Alexandrium catenella-Blüteereignisses. Schädliche Algen. 2013;24:20–31.

Artikel CAS Google Scholar

Lofgren LA, Uehling JK, Branco S, Bruns TD, Martin F, Kennedy PG. Genombasierte Schätzungen der Variation der rDNA-Kopienzahl von Pilzen über phylogenetische Skalen und ökologische Lebensstile hinweg. Mol Ecol. 2019;28:721–30.

Artikel PubMed Google Scholar

Yarimizu K, Sildever S, Hamamoto Y, Tazawa S, Oikawa H, Yamaguchi H, et al. Entwicklung einer absoluten Quantifizierungsmethode für ribosomale RNA-Genkopienzahlen pro eukaryontischer Einzelzelle durch digitale PCR. Schädliche Algen. 2021;103:102008.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nishimura T, Hariganeya N, Tawong W, Sakanari H, Yamaguchi H, Adachi M. Quantitativer PCR-Assay zum Nachweis und zur Zählung von Ciguatera-verursachenden Dinoflagellaten Gambierdiscus spp. (Gonyaulacales) in Küstengebieten Japans. Schädliche Algen. 2016;52:11–22.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nelson JO, Watase GJ, Warsinger-Pepe N, Yamashita YM. Mechanismen der Aufrechterhaltung der rDNA-Kopienzahl. Trends Genet. 2019;35:734–42.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ide S, Miyazaki T, Maki H, Kobayashi T. Die Fülle an ribosomalen RNA-Genkopien erhält die Genomintegrität aufrecht. Wissenschaft. 2010;327:693–6.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kobayashi T. Regulierung der Kopienzahl ribosomaler RNA-Gene und ihre Rolle bei der Modulation der Genomintegrität und der evolutionären Anpassungsfähigkeit in Hefen. Cell Mol Life Sci. 2011;68:1395–403.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nemergut DR, Knelman JE, Ferrenberg S, Bilinski T, Melbourne B, Jiang L, et al. Abnahme der durchschnittlichen rRNA-Operon-Kopienzahl der Bakteriengemeinschaft während der Sukzession. ISME J. 2016;10:1147–56.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lavrinienko A, Jernfors T, Koskimäki JJ, Pirttilä AM, Watts PC. Beeinflusst die intraspezifische Variation der rDNA-Kopienzahl die Analyse mikrobieller Gemeinschaften? Trends in der Mikrobiologie. 2021;29:19–27.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hou Y, Ji N, Zhang H, Shi J Phycol. 2019;55:37–46.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hou Y, Lin S. Deutliche Beziehungen zwischen Genanzahl und Genomgröße für Eukaryoten und Nicht-Eukaryoten: Schätzung des Gengehalts für Dinoflagellatengenome. Plus eins. 2009;4:e6978.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Figueroa RI, Cuadrado A, Stüken A, Rodríguez F, Fraga S. Ribosomale DNA-Organisationsmuster innerhalb der Dinoflagellatengattung Alexandrium, wie von FISH enthüllt: Lebenszyklus und evolutionäre Implikationen. Protist. 2014;165:343–63.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu Y, Hu Z, Deng Y, Shang L, Gobler CJ, Tang YZ. Abhängigkeit der Genomgröße und der Kopienzahl des rRNA-Gens vom Zellvolumen in Dinoflagellaten. Schädliche Algen. 2021;109:102108.

Artikel PubMed Google Scholar

Kohli GS, John U, Figueroa RI, Rhodes LL, Harwood DT, Groth M, et al. Polyketidsynthesegene, die mit der Toxinproduktion in zwei Arten von Gambierdiscus (Dinophyceae) assoziiert sind. BMC-Genomik. 2015;16:410.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ott BM, Litaker RW, Holland WC, Delwiche CF. Verwendung von RDNA-Sequenzen zur Definition von Dinoflagellatenarten. PLUS EINS. 2022;17:e0264143.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McNichol J, Berube PM, Biller SJ, Fuhrman JA Bewertung und Verbesserung der rRNA-PCR-Primerabdeckung kleiner Untereinheiten für Bakterien, Archaeen und Eukaryoten unter Verwendung von Metagenomen aus globalen Ozeanuntersuchungen. mSystems 2021; 6: https://doi.org/10.1128/msystems.00565-21.

Parada AE, Needham DM, Fuhrman JA. Jede Basis zählt: Bewertung von rRNA-Primern kleiner Untereinheiten für marine Mikrobiome mit Scheingemeinschaften, Zeitreihen und globalen Feldproben. Umwelt Mikrobiol. 2016;18:1403–14.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gonzalez-de-Salceda L, Garcia-Pichel F. Die Allometrie der zellulären DNA und des ribosomalen Gengehalts bei Mikroben und ihre Verwendung zur Beurteilung der Mikrobiom-Gemeinschaftsstruktur. Mikrobiom. 2021;9:173.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Louca S, Doebeli M, Parfrey LW. Die Korrektur der 16S-rRNA-Genkopienzahlen in Mikrobiomuntersuchungen bleibt ein ungelöstes Problem. Mikrobiom. 2018;6:41.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Stoddard SF, Smith BJ, Hein R, Roller BRK, Schmidt TM. rrnDB: verbesserte Werkzeuge zur Interpretation der rRNA-Genhäufigkeit in Bakterien und Archaeen und eine neue Grundlage für die zukünftige Entwicklung. Nukleinsäuren Res. 2015;43:D593–598.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Godhe A, Cusack C, Pedersen J, Andersen P, Anderson DM, Bresnan E, et al. Interkalibrierung klassischer und molekularer Techniken zur Identifizierung von Alexandrium fundyense (Dinophyceae) und Schätzung der Zelldichten. Schädliche Algen. 2007;6:56–72.

Artikel CAS Google Scholar

Smith KF, Kohli GS, Murray SA, Rhodes LL. Bewertung des Metabarcoding-Ansatzes zur Gemeinschaftsanalyse benthisch-epiphytischer Dinoflagellaten unter Verwendung von Scheingemeinschaften. NZJ Marine Freshwater Res. 2017;51:555–76.

Artikel CAS Google Scholar

Santi I, Kasapidis P, Karakassis I, Pitta P. Ein Vergleich von DNA-Metabarcoding- und Mikroskopiemethoden für die Untersuchung aquatischer mikrobieller Eukaryoten. Diversität. 2021;13:180.

Artikel CAS Google Scholar

Martin JL, Santi I, Pitta P, John U, Gypens N. Auf dem Weg zur quantitativen Metabarkodierung von eukaryotischem Plankton: ein Ansatz zur Verbesserung der Verzerrung der Kopienzahl des 18S-rRNA-Gens. MBMG. 2022;6:e85794.

Artikel Google Scholar

Kretzschmar AL, Verma A, Kohli G, Murray S. Entwicklung eines quantitativen PCR-Assays zum Nachweis und zur Zählung eines potenziell Ciguatoxin-produzierenden Dinoflagellaten, Gambierdiscus lapillus (Gonyaulacales, Dinophyceae). PLUS EINS. 2019;14:e0224664.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Menden-Deuer S, Lessard EJ. Kohlenstoff-Volumen-Beziehungen für Dinoflagellaten, Kieselalgen und anderes protistisches Plankton. Limnol Oceanogr. 2000;45:569–79.

Artikel CAS Google Scholar

Zhu F, Massana R, Not F, Marie D, Vaulot D. Kartierung von Picoeukaryoten in Meeresökosystemen mit quantitativer PCR des 18S-rRNA-Gens. FEMS Microbiol Ecol. 2005;52:79–92.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vandersea MW, Kibler SR, Holland WC, Tester PA, Schultz TF, Faust MA, et al. Entwicklung semiquantitativer PCR-Assays zum Nachweis und zur Zählung von Gambierdiscus-Arten (Gonyaulacales, Dinophyceae). J Phycol. 2012;48:902–15.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nand A, Zhan Y, Salazar OR, Aranda M, Voolstra CR, Dekker J. Genetische und räumliche Organisation der ungewöhnlichen Chromosomen des Dinoflagellaten Symbiodinium microadriaticum. Naturgenetik. 2021;53:618–29.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kretzschmar AL, Verma A, Murray S, Kahlke T, Fourment M, Darling AE. Phylogenetischer Versuch – Bewertung der Multi-Spezies-Koaleszenz zur phylogenetischen Schlussfolgerung auf Taxa mit hohem Paralogieniveau (Gonyaulacales, Dinophyceae). bioRxiv. https://doi.org/10.1101/683383.

Farrell H, O'Connor WA, Seebacher F, Harwood TD, Murray S. Molekularer Nachweis des SxtA-Gens aus Saxitoxin produzierendem Alexandrium minutum in kommerziellen Austern. J Shellfish Res. 2016;35:169–77.

Artikel Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken der Roscoff Culture Collection, Helene Hegaret, Laure Guillou, Marc Long, Malwenn Lassudrie, der Cawthron Collection und CSIRO für die in dieser Studie verwendeten Kulturen. Wir danken Kun Xiao für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Wir danken Jacqui Stuart für ihre Hilfe bei den Zahlen. Diese Studie wurde teilweise durch ein UTS HDR-Stipendium an RR und ein Australian Research Council FT an SM unterstützt.

University of Technology Sydney, School of Life Sciences, Sydney, PO Box 123, Broadway, NSW, 2007, Australien

Rendy Ruvindy, Abanti Barua, Henna Savela und Shauna A. Murray

Institut für Meeres- und Antarktisstudien, University of Tasmania, Launceston, 7248, TAS, Australien

Christopher JS Bolch

Sydney Institute of Marine Science, Chowder Bay Rd, Mosman, NSW, Australien

Chowdhury Sarowar

Finnisches Umweltinstitut, Meeresforschungszentrum, Helsinki, Finnland

Henna Savela

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

RR und SM konzipierten und gestalteten die Studie. RR, CB, SM, AB, CS generierten und analysierten Daten, HS trug zum experimentellen Design sowie zur Probensammlung und -analyse bei. RR, SM und CB haben das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Shauna A. Murray.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ruvindy, R., Barua, A., Bolch, CJS et al. Die Variabilität der genomischen Kopienzahl auf Gattungs-, Arten- und Populationsebene wirkt sich auf ökologische In-situ-Analysen von Dinoflagellaten und schädlichen Algenblüten aus. ISME COMMUN. 3, 70 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00274-0

Zitat herunterladen

Eingegangen: 23. Dezember 2022

Überarbeitet: 18. Juni 2023

Angenommen: 20. Juni 2023

Veröffentlicht: 08. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00274-0

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt