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May 17, 2024

Reverse Transkription

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11470 (2023) Diesen Artikel zitieren 9845 Zugriff auf 4 altmetrische Metrikdetails Das in diesem Artikel dargestellte Verfahren stellt eine neue Methode für das Transkriptom dar

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11470 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Das in diesem Artikel dargestellte Verfahren stellt eine neue Methode zur Transkriptomanalyse mittels PCR (Polymerase-Kettenreaktion) dar, die die Beseitigung potenzieller DNA-Kontaminationen überflüssig macht. Im Vergleich zu den bestehenden Methoden ist unsere Methode präziser, einfacher und reproduzierbarer, da sie die Integrität der RNA bewahrt, keine Materialien und/oder Reagenzien erfordert, die zur Eliminierung der DNA verwendet werden, und außerdem die Anzahl der zu bestimmenden Proben reduziert als Negativkontrollen verwendet. Dieses neuartige Verfahren beinhaltet die Verwendung eines speziell modifizierten Primers während des Reverse-Transkriptionsschritts, der nicht übereinstimmende Basen enthält und so cDNA-Moleküle produziert, die sich von genomischer DNA unterscheiden. Durch die Verwendung desselben modifizierten Primers bei der PCR-Amplifikation wird nur die cDNA-Matrize amplifiziert, da die genomische DNA-Matrize teilweise heterolog zum Primer ist. Auf diese Weise bleibt die Amplifikation durch PCR von einer möglichen DNA-Kontamination unbeeinflusst, da sie nur für die cDNA-Matrize spezifisch ist. Darüber hinaus spiegelt es genau die anfängliche RNA-Konzentration der Probe wider, die aufgrund verschiedener physikalischer oder enzymatischer Behandlungen, die bei den aktuellen Methoden zur DNA-Eliminierung üblicherweise verwendet werden, zu Veränderungen neigt. Die Methode eignet sich besonders zur Quantifizierung hochrepetitiver DNA-Transkripte, wie beispielsweise Satelliten-DNA.

Die qualitative und/oder quantitative Analyse von Transkripten mittels PCR-Amplifikation ist eine Methode der Wahl sowohl in der molekularbiologischen Forschung als auch in der medizinischen Diagnostik1. Es wird häufig zum Nachweis und zur Quantifizierung vieler verschiedener Arten von Transkripten wie Boten-RNA, ribosomaler RNA, nicht-kodierender RNA usw. verwendet. Zu den häufigsten Anwendungen gehören die Genexpressionsanalyse und die genaue Identifizierung eines bestimmten Mikroorganismus.

Um ordnungsgemäß analysiert zu werden, wird die gereinigte RNA einem vorbereitenden und grundlegenden Schritt der reversen Transkription unterzogen, bei dem die RNA-Moleküle durch das Enzym Reverse Transkriptase in cDNA (komplementäre DNA) umgewandelt werden. Tatsächlich kann die RNA selbst bei den nachfolgenden PCR-Schritten nicht direkt amplifiziert werden und muss zwingend in cDNA1 umgewandelt werden. Das Hauptproblem der meisten derzeit verwendeten Protokolle liegt in der häufig vorhandenen DNA-Kontamination, die durch das Polymerase-Enzym während der PCR-Amplifikation auf struktureller Ebene nicht chemisch von der cDNA unterschieden werden kann, was zu falsch positiven Ergebnissen führt2,3,4,5, 6,7. Um diese Einschränkung zu überwinden, umfassen alle aktuellen Protokolle einige Schritte zur DNA-Eliminierung, sowohl während der RNA-Reinigung als auch im anschließenden Schritt der reversen Transkription. In beiden Fällen würde die DNA entweder mit Hilfe spezifischer mechanischer Filter (Säulen auf Kieselsäurebasis) oder durch enzymatischen Verdau durch ein spezifisches Enzym wie DNase I (Desoxyribonuklease I)8 eliminiert. Diese Behandlungen sind jedoch nicht zu 100 % wirksam bei der Entfernung von DNA, die oft als DNA-Kontamination zurückbleibt2,3. Dies ist insbesondere bei stark repetitiver DNA der Fall, die einen wesentlichen Teil des eukaryotischen Genoms ausmacht und häufig in geringem Umfang transkribiert wird. Darüber hinaus sollte betont werden, dass jedes Verfahren zur Verringerung der DNA-Konzentration in der Probe sicherlich auch zu einer Verringerung der Anfangskonzentration der RNA selbst führt, einem Molekül, das von Natur aus instabil und leicht abbaubar ist.

Hier berichten wir über eine neuartige Methode zur Transkriptomanalyse mittels PCR, bei der cDNA und DNA differenziert werden und somit eine Kontamination durch letztere ausgeschlossen wird, wodurch präzisere, zuverlässigere und reproduzierbarere Ergebnisse erzielt werden.

Vorwärts-, Rückwärts- und modifizierte Primer, die zum Testen des neuen Protokolls verwendet werden, sind in Tabelle 1 dargestellt. Der modifizierte spezifische Primer unterscheidet sich von den unmodifizierten Vorwärts- und Rückwärtsprimern durch nur vier Basenveränderungen (Punktmutationen), die abwechselnd mit unveränderten Nukleotiden verteilt sind und mit dem beginnen 3'-Ende des Primers (in Tabelle 1 fett markiert).

Wir haben auch Primer getestet, die auf andere Weise modifiziert wurden (von zwei auf sechs Übergänge/Transversionen am 3'-Ende, mit und ohne oben genannten Wechsel), aber die besten und konsistentesten Ergebnisse wurden mit 4 abwechselnden Fehlpaarungen am 3'-Ende für 20–26 erzielt bp lange Primer. Natürlich können bei längeren Primern mehr Mutationen einbezogen werden, aber unserer Erfahrung nach erwiesen sich vier Fehlpaarungen als notwendige und ausreichende Anzahl an Modifikationen, um die erwarteten Ergebnisse zu erzielen. In unserem Fall veränderten die modifizierten Primer die Komplementarität zwischen Primer und Ziel, während die Spezifität und Thermodynamik der Primer selbst erhalten blieben. Die Liste aller entworfenen Primer ist in Tabelle 1 aufgeführt.

Ein Escherichia coli-Stamm (AB1157), der zum Testen der ssb-, sulA- und recA-Genexpression verwendet wurde, enthielt ein Multikopie-Plasmid, pID2, für eine erhöhte Expression des ssb-Gens9. ssb (kodiert für ein essentielles, konserviertes SSB-Protein, das den DNA-Metabolismus reguliert), sulA (unter SOS-Kontrolle, kodiert für SulA-Inhibitor der Zellteilung) und recA (kodiert für eine konservierte bakterielle Rekombinase, RecA). Die Bakterien wurden in LB-Medium unter Belüftung bei 37 °C gezüchtet, bis sie eine OD600 ~ 0,4 erreichten, und anschließend wurde RNA daraus isoliert.

Die RNA wurde mit dem RNeasy Plus Mini-Kit (Qiagen) gereinigt, das gemäß den Anweisungen des Herstellers einen Schritt zur Eliminierung genomischer DNA durch Festphasen-Säulenextraktion umfasst. Auf diese Weise behandelte Proben werden als + DNase I und diejenigen, die nicht zur Eliminierung genomischer DNA behandelt wurden, als – DNase I bezeichnet.

Ungefähr 1 μg RNA, quantifiziert durch Quant-IT RNA unter Verwendung eines Qubit-Fluorometers (Invitrogen, Waltham, MA, USA), wurde mit dem PrimeScript RT-Reagenzienkit ohne gDNA Eraser (+ RT/– DNase I) oder mit gDNA Eraser revers transkribiert (+ RT/ + DNase I) (Takara, Dalian, China) unter Verwendung einer 0,2 µM-Mischung aus spezifisch modifizierten oder zufälligen Hexamer-Primern (aus dem Kit) für die ssb-, sulA- und recA-Expressionsanalyse, sowohl für die neue als auch für die aktuelle Methode. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die DNA der mit + DNase I bezeichneten Proben sowohl durch eine auf Kieselsäure basierende Säule während der RNA-Isolierung als auch durch einen gDNA-Eraser (DNase I-Behandlung) während des Reverse-Transkriptionsschritts eliminiert wurde. Für alle Proben wurden Negativkontrollen ohne Reverse-Transkriptase-Enzym (-RT) hergestellt.

Das auf Nanoplatten basierende dPCR-Verfahren wurde mit dem QIAcuity 2-Plex-Gerät (Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Das dPCR-Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung von QIAcuity 3X Eva Green PCR Master Mix, 10X Primermix (2 µM), RNase-freiem Wasser und einer festen Konzentration an cDNA-Matrize in einem Endvolumen von 15 µL pro Probe zusammengestellt. Nach sorgfältigem Vortexen wurden 12 µL der vorbereiteten Mischung auf die 24-Well-8,5-K-Nanoplatte übertragen und mit einer Nanoplatten-Gummidichtung versiegelt. Zur Qualitätskontrolle von QIAcuity dPCR wurde der Assay mit unterschiedlichen Mengen an cDNA-Template-Input (24, 12 und 6 ng) repliziert und durch Quant-IT ssDNA unter Verwendung eines Qubit-Fluorometers (Invitrogen, Waltham, MA, USA) quantifiziert. Die Sequenzen der Primer für den Transkriptnachweis der ssb-, sulA- und recA-Gene sind in Tabelle 1 angegeben.

Die Ergebnisse für alle Proben wurden unter Verwendung einer 24-ng-Template-Eingabe erhalten, mit Ausnahme der SSB-Genexpressionsanalyse in der aktuellen Methode, die aufgrund des Vorhandenseins von Multikopie-Plasmiden, die SSB exprimieren, mit einer 60-fach verdünnten Zielprobe im Vergleich zu den für die neue Methode verwendeten Proben durchgeführt wurde Gen (Abb. 2A).

Die 8,5 K-Nanoplatte führt zu 8500 einzelnen Partitionen, in denen das Templat zufällig verteilt ist. Das QIAcuity führt eine vollautomatische Probenverarbeitung durch, einschließlich aller notwendigen Schritte zur Plattenvorbereitung, Abdichtung von Trennwänden, Thermocycling und Bildanalyse. Das Amplifikationszyklusprotokoll bestand aus 2 Minuten bei 95 °C für den Enzymaktivierungsschritt und den folgenden 40 Zyklen von 15 Sekunden. bei 95 °C zur Denaturierung, 15 s. bei 60 °C zum Glühen und 15 s. bei 72 °C zur Verlängerung, abschließend mit dem letzten Schritt bei 40 °C für 5 Minuten. Fluoreszierendes Licht wird von positiven Partitionen emittiert, die ein Zielmolekül enthalten, im Gegensatz zu solchen ohne dieses, den negativen Partitionen. Die Daten wurden mit der QIAcuity Suite Software V1.1.3 (Qiagen) analysiert und die Ergebnisse wurden als Kopien von cDNA/µl basierend auf Poisson-Verteilungsanalysen ausgedrückt. Die von der Maschine erzeugten Partitionen ähneln dem Poisson-Prozess, da die Ziele unabhängig voneinander und mit einer festen Rate in verschiedenen Partitionen landen. Die Poisson-Verteilung gibt Wahrscheinlichkeiten für positive ganzzahlige Zufallsereignisse an. Der Schlüsselparameter dieser Verteilung ist der Erwartungswert für diese Ereignisse, also die mittlere Wahrscheinlichkeit für einen Anteil eines Zählvorgangs bzw. des Zählvorgangs an sich für die dPCR-Analyse. Darüber hinaus verfügt QIAcuity über eine eingebettete Software, die zuverlässige Statistiken quantifizieren und erstellen kann. In unserem Fall war das von uns berücksichtigte statistische Maß das Poisson-Konfidenzintervall auf einem 95-%-Niveau, das bei der Darstellung (Fehlerbalken) zeigt, ob sich die Ereignisse mit 95-prozentiger Sicherheit unterscheiden oder nicht.

Alpha-Satelliten-RNA (ASAT) wurde aus der menschlichen Gebärmutterhalskrebs-Zelllinie HeLa (erhalten von ATCC (USA) unter Verwendung des RNeasy Plus Mini-Kits (Qiagen) isoliert. Die Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (beide von Sigma, MA, kultiviert). USA), in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 und bei 37 °C.) TCAST1-Satelliten-RNA wurde aus erwachsenen Tribolium castaneum-Käfern unter Verwendung des RNeasy Plus Mini-Kits (Qiagen) isoliert, das einen Schritt zur Eliminierung genomischer DNA durch Festphasen-Säulenextraktion umfasst. Ungefähr 1 μg RNA, quantifiziert durch Quant-IT RNA unter Verwendung eines Qubit-Fluorometers (Invitrogen, Waltham, MA, USA), wurde unter Verwendung des PrimeScript RT-Reagenzienkits mit gDNA Eraser (Takara, Dalian, China) in 10 μl Reaktionslösung revers transkribiert unter Verwendung speziell modifizierter Primer für die ASAT- und TCAST1-Expressionsanalyse. Für alle Proben wurden auch Negativkontrollen ohne Reverse-Transkriptase-Enzym hergestellt.

Die qPCR-Analyse wurde gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll10,11 durchgeführt. Primer für die Expressionsanalyse menschlicher Alpha-Satelliten-DNA wurden gemäß der Alpha-Satelliten-Konsensussequenz12 und TCAST1-Primer gemäß der eigenen Satelliten-Konsensussequenz13 konstruiert. Glucuronidase β (GUSB-Gene ID: 2990) und ribosomales Protein S18 (RPS18) wurden als endogene Kontrollen zur Normalisierung in menschlichen bzw. Tribolium-Proben verwendet und wurden ohne signifikante Variation zwischen den Proben stabil exprimiert. Die folgenden Temperaturwechselbedingungen wurden verwendet: 50 °C 2 min; 95 °C 7 Min.; 95 °C 15 s; 60 °C 1 Minute für 40 Zyklen, gefolgt von der Dissoziationsphase: 95 °C für 15 Sekunden; 60 °C für 1 Minute; 95 °C für 15 s; und 60 °C für 15 s. Die Amplifikationsspezifität wurde durch Dissoziationskurvenanalyse bestätigt und die Spezifität der amplifizierten Produkte wurde auf Agarosegel getestet. In jedem Lauf war eine Kontrolle ohne Vorlage (NTC) enthalten. Die Daten nach dem Lauf wurden mit der LinRegPCR-Software v.11.1 analysiert. Dies ermöglicht die Berechnung der Ausgangskonzentration des Amplikons in der Probe („N0-Wert“). Der N0-Wert wird in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten ausgedrückt und unter Berücksichtigung der PCR-Effizienz und der Basisfluoreszenz berechnet. Der für jedes technische Replikat ermittelte „N0-Wert“ wurde gemittelt und die gemittelten „N0-Werte“ wurden durch die „N0-Werte“ der endogenen Kontrolle dividiert (Abb. 5B und 6B). In diesem Artikel haben wir beschlossen, auch die grafische Darstellung der Rohdatenamplifikationsdiagramme von Delta Rn vs. Zyklus zu zeigen (Abb. 5A und 6A, ergänzende Abb. 1).

Unsere vorgeschlagene Methode, schematisch in Abb. 1 dargestellt, nutzt die Verwendung eines modifizierten Primers (Modified Specific Primer, PSM) während des Reverse-Transkriptionsschritts des Protokolls. Ein solcher Primer ist spezifisch für die zu quantifizierenden RNA-Moleküle und seine Nukleotidsequenz ist so konzipiert, dass sie keine perfekte Homologie zur retrotranskribierten Matrizen-DNA aufweist. Im Allgemeinen reicht es aus, wenige Fehlpaarungen in Bezug auf die ursprüngliche Sequenz hinzuzufügen, vorzugsweise in unmittelbarer Nähe der 3'-OH-terminalen Region. Durch diese Modifikationen ist der Primer teilweise komplementär zur Zielsequenz, kann aber dennoch bei den Temperaturen von 37–42 °C, die während des Reverse-Transkriptionsschritts verwendet werden, hybridisieren. Dennoch dissoziiert das PSM während des PCR-Schritts von der teilweise homologen genomischen DNA-Sequenz, sobald die Betriebstemperatur etwa 60 °C erreicht. Das Ziel der Verwendung eines solchen bequem modifizierten spezifischen Primers besteht darin, eine Amplifikation spezifisch aus der cDNA-Matrize zu erreichen und gleichzeitig genomische DNA-Ziele erfolgreich zu vermeiden. Die richtige Anzahl der anzuwendenden Modifikationen, ihre Wirksamkeit und die richtigen Unterscheidungstemperaturen sollten für jedes einzelne zu analysierende Transkript experimentell getestet werden, indem diejenigen Parameter ausgewählt werden, die negative bzw. positive Amplifikationstendenzen gegenüber DNA- und cDNA-Zielen zeigen. Diese Optimierungsphase stellt einen Vorschritt unserer Methode dar, der die Einrichtung von Negativ- und Positivkontrollen ermöglicht und vorteilhafterweise nur einmal durchgeführt werden muss, da sie immer für ein bestimmtes Amplifikat gültig bleibt und auf eine unterschiedliche Anzahl von Replikaten angewendet werden kann unter verschiedenen Versuchsbedingungen. Tatsächlich sollte in aktuellen Protokollen die Negativkontrolle (NC: – RT, ohne Reverse Transkriptase) aufgrund der zufälligen Wirksamkeit der DNase I-Behandlung idealerweise für jede neue zu testende Probe vorbereitet werden, auch wenn das Ziel dasselbe ist. Mit einem PSM sind wir in der Lage, cDNA zu erzeugen, die sich aufgrund der in der Sequenz vorhandenen Nukleotidfehlpaarungen geringfügig von ihrem genomischen DNA-Gegenstück unterscheidet.

Schematische Darstellung der neuen Methode. (A) Grundmodell des Nukleinsäurestoffwechsels von DNA zu cDNA. Durch die Integration des modifizierten spezifischen Primers in die cDNA mittels reverser Transkription wird dieser zu einem dauerhaften Bestandteil der Sequenz. (B) Amplifikation der Zielsequenz mittels Polymerase-Kettenreaktion. Durch modifizierte spezifische Primer umgewandelte cDNA wird bei einer bestimmten Unterscheidungstemperatur ordnungsgemäß amplifiziert, während genomische DNA-Ziele erfolgreich vermieden werden.

In der Phase nach der reversen Transkription (Abb. 1B) erfolgt die Amplifikation der cDNA durch PCR unter Verwendung desselben modifizierten Primers (PSM) aus dem vorherigen Schritt zusätzlich zu den unmodifizierten spezifischen Primern (SP) beginnend in der entgegengesetzten Richtung. Folglich ist das resultierende Amplikon eine Kopie der cDNA und nicht der DNA, da die spezifisch selektiven Annealing-Temperaturen normalerweise zwischen 55 °C und 62 °C liegen. Daher besteht bei diesem Verfahren keine Notwendigkeit, die mitgereinigte DNA aus der RNA-Probe zu entfernen, da sie kein konkurrierendes Ziel mehr ist und das Endergebnis des Tests nicht beeinflusst. In der Tat könnte es unter bestimmten experimentellen Bedingungen nützlich und vorteilhaft sein, sowohl DNA als auch RNA zusammen in derselben Probe vorhanden zu haben, wenn beispielsweise die Ergebnisse im Hinblick auf die Variation der Genkopienzahl normalisiert werden müssen.

Unsere vorgeschlagene neue Methode kann in verschiedenen experimentellen Untersuchungen eingesetzt werden und wurde für die Zwecke dieser Arbeit durch die Analyse von drei bakteriellen E. coli-Genen getestet: ssb, sulA und recA (Abb. 2, 3 und 4) sowie zwei Satelliten DNA-Transkripte: menschlicher Alpha-Satellit (ASAT) (Abb. 5 und 6 und ergänzende Abb. 2) und TCAST1-Satellit aus Tribolium castaneum (ergänzende Abb. 1).

Transkription des ssb-Gens in exponentiell wachsenden E. coli-Zellen, die das ssb-Überexpressionsplasmid pID2 beherbergen, erhalten durch dPCR unter Verwendung der aktuellen (A) und der neuen Methode (B). Die Spalten stellen die Anzahl der Kopien/µl dar und der dargestellte Fehlerbalken zeigt, ob sich die Ereignisse mit einem 95 %-Poisson-Konfidenzintervall unterscheiden oder nicht.

Transkription des recA-Gens in exponentiell wachsenden E. coli-Zellen, erhalten durch dPCR unter Verwendung aktueller und neuer Methoden. Die Spalten stellen die Anzahl der Kopien/µl dar und der dargestellte Fehlerbalken zeigt, ob sich die Ereignisse mit einem 95 %-Poisson-Konfidenzintervall unterscheiden oder nicht.

Transkription des sulA-Gens in exponentiell wachsenden E. coli-Zellen, erhalten durch dPCR unter Verwendung aktueller und neuer Methoden. Die Spalten stellen die Anzahl der Kopien/µl dar und der dargestellte Fehlerbalken zeigt, ob sich die Ereignisse mit einem 95 %-Poisson-Konfidenzintervall unterscheiden oder nicht.

Delta-Rn-gegen-Zyklus-Diagramm von Alpha-Satelliten-DNA, isoliert aus HeLa-Zellen, erhalten durch qPCR unter Verwendung der aktuellen Methode (A) und der neuen Methode (B). + RT und – RT stellen positive bzw. negative Kontrollen mit bzw. ohne reverse Transkription dar.

Transkriptionsniveau der Alpha-Satelliten-DNA, erhalten durch qPCR mit der aktuellen Methode (A) und der neuen Methode (B). Die Spalten zeigen den Durchschnitt von zwei unterschiedlich geladenen Proben in dreifach durchgeführten qPCR-Experimenten. N0 stellt den normalisierten durchschnittlichen N0-Wert für den Alpha-Satelliten dar. C stellt Alpha-Proben mit umgekehrter Transkription dar und NC stellt Negativkontrollen ohne umgekehrte Transkription dar und M ist ein 100-bp-Größenmarker.

Bakterielle Gene sind ein gutes experimentelles Modell zum Testen unserer Methode, da sie in ihrer kodierenden Region keine Introns enthalten, wodurch die Möglichkeit einer Unterscheidung zwischen Transkripten und DNA aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe ausgeschlossen ist. Daher könnte die Technik angewendet werden, um die Expression aller Gene zu testen, die mit einem kurzen oder Null-Intron organisiert sind (z. B. virale Gene).

Der in diesem Test verwendete Bakterienstamm wurde mit einem Multikopie-Plasmid transformiert, das ein kloniertes ssb-Gen9 trug, das während der Quantifizierung der Transkripte durch PCR um die Amplifikation mit ssb-cDNA konkurrieren konnte, sofern keine zusätzlichen DNase I-Behandlungen durchgeführt wurden. Die in Abb. 2 angegebenen Ergebnisse zeigen einen großen Unterschied (mehr als das 40-fache) der mit unserer Methode gemessenen SSB-Transkriptionsniveaus im Vergleich zur derzeit verwendeten Methode. Dieser wirklich hohe Grad an amplifizierter SSB-Sequenz im letztgenannten Ansatz, bei dem keine reverse Transkription durchgeführt wurde und die DNA sowohl in der RNA-Isolierung als auch in den RT-Schritten eliminiert wurde (Abb. 2A), ist wahrscheinlich auf die geringe Effizienz der Eliminierung kovalent geschlossener Sequenzen zurückzuführen zirkuläre Plasmid-DNA, was bedeutet, dass sie falsch ist (dh sie stellt den Transkriptionsprozess nicht genau dar) und tatsächlich durch DNA-Kontamination verursacht wird.

Dies ist wahrscheinlich ein Grund für alle beobachteten Fälle einer hohen Amplifikation der SSB-Sequenz unter Verwendung klassischer Primer (Abb. 2A). Im Gegensatz dazu wurde die ssb-Sequenz durch unsere neue Methode nur in den Fällen amplifiziert, in denen eine reverse Transkription durchgeführt wurde, dh wenn cDNA erstellt wurde (Abb. 2B). Der Grad der SSB-Sequenzverstärkung hing nicht von der DNA-Eliminierung ab (Abb. 2B), was die Unempfindlichkeit unserer Methode gegenüber dem Vorhandensein von genomischer (und Plasmid-)DNA bestätigt. Als nächstes quantifizierten wir die Expression der recA- und sulA-Gene, die als einzelne Kopien im E. coli-Genom vorhanden sind. In Übereinstimmung mit dem vorherigen Assay wurde mit unserer Methode keine Amplifikation der recA-Sequenz beobachtet, es sei denn, cDNA wurde durch reverse Transkription erstellt (Abb. 3). Das Ausmaß der Amplifikation der recA-Sequenz war wiederum unabhängig von der Eliminierung genomischer DNA aus der Probe (Abb. 3). Im Gegensatz dazu zeigte die aktuelle Methode, die Standardprimer verwendet, ein falsch positives Signal, selbst wenn der Schritt der umgekehrten Transkription übersprungen wurde und die genomische DNA durch die DNase-I-Behandlung (offensichtlich unvollständig) eliminiert wurde (Abb. 3).

Schließlich stimmte die Analyse der sulA-Genexpression unter Verwendung eines modifizierten Primers mit den vorherigen Tests überein, da die Amplifikation der sulA-Sequenz erst nach der reversen Transkription erfolgte, d. h. sie war spezifisch für cDNA (Abb. 4). Dementsprechend wurde nach der Eliminierung genomischer DNA kein Effekt beobachtet (Abb. 4). Im Gegensatz dazu war die Amplifikation der sulA-Sequenz unter Verwendung von Standardprimern sehr unterschiedlich und wurde auch in Situationen, in denen genomische DNA eliminiert und keine reverse Transkription durchgeführt wurde, nicht aufgehoben (Abb. 4); Theoretisch sollte die – RT/ + DNase I-Probe keine cDNA oder genomische DNA enthalten.

Die präsentierten Ergebnisse zeigen deutlich, dass unsere Methode der Verwendung eines modifizierten Primers während der cDNA-Synthese ein cDNA-spezifisches PCR-Signal erzeugt, das unabhängig von genomischer DNA ist und daher die Genexpression viel genauer quantifiziert als die häufig verwendete Standardmethode Leider ergibt sich keine echte Negativkontrolle, da immer die Möglichkeit besteht, dass die Probe kontaminierende DNA enthält.

Satelliten-DNA stellt einen der besten Zielkandidaten für den Nachweis der Wirksamkeit unserer Methodik dar, da es sich um eine sich stark wiederholende, nicht-kodierende genomische DNA handelt, die in der Probe immer in großen Mengen vorhanden ist und daher bei der RNA-Reinigung nur schwer, wenn nicht gar unmöglich, entfernt werden kann .

Alpha-Satelliten-DNA ist die am häufigsten vorkommende menschliche Satelliten-DNA mit einer Länge von 171 bp und macht bis zu 10 % des Genoms aus14. Abbildung 5A zeigt qPCR-Ergebnisse, die nach dem aktuellen Standardprotokoll (alte Methode) erhalten wurden, was die Eliminierung von DNA sowohl während der RNA-Reinigungs- als auch der Reverse-Transkriptionsphase beinhaltet. Trotzdem bleibt die Alpha-Satelliten-DNA weiterhin in den Negativkontrollproben (– RT) bestehen. Da Satelliten-DNA außerdem nicht in Exons und Introns organisiert ist, kann sie anhand ihrer Länge nicht von Satelliten-cDNA unterschieden werden. Daher führt selbst die geringste Spur einer DNA-Kontamination häufig zu falsch positiven Ergebnissen. Die neue Methode zeigte jedoch erfolgreich das Verschwinden der Alpha-Satelliten-DNA-Kontamination aus den qPCR-Amplifikationsergebnissen (Abb. 5B, – RT), wie auch durch Laden der Amplifikate auf Agarosegel deutlich zu erkennen ist (Suppl. Abb. 2). ): Das 126 bp lange ASAT-Amplikon ist nur in + RT-Proben (C: Kontrollen) im Vergleich zu – RT-Proben (NC: Negativkontrolle) vorhanden. Die gleichen Ergebnisse konnten wie in Abb. 6A (aktuelle Methode) und Abb. 6B (neue Methode) dargestellt werden, wobei „N0-Wert“ die Anfangskonzentration des Amplikons in der Probe ist und die Spalten den Durchschnitt von zwei unterschiedlich geladenen Proben in qPCR-Experimenten zeigen in dreifacher Ausfertigung durchgeführt (siehe Abschnitt „Materialien und Methode“).

Die sehr häufig vorkommende Satelliten-DNA TCAST1 wurde zuvor als der Hauptsatellit charakterisiert, der bis zu 30 % des Genoms des Käfers Tribolium castaneum ausmacht und die zentromeren sowie perizentromeren Regionen aller 20 Chromosomen organisiert10,13. Auch hier wurde mit der neuen Methode nur cDNA amplifiziert (+ RT-Proben) und in RT-Proben wurde fast keine genomische DNA-Kontamination festgestellt (Suppl. Abb. 1). Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass sie genau mit denen übereinstimmen, die für die menschliche Alpha-Satelliten-DNA erhalten wurden.

Zusammenfassend können wir bestätigen, dass die Ergebnisse, die durch die Anwendung unserer neuen Methode zur Quantifizierung verschiedener Arten von Transkripten erzielt werden, sicherlich präziser, reproduzierbarer und erschwinglicher sind als die Ergebnisse, die mit derzeit verwendeten Protokollen erzielt werden. Dies liegt daran, dass unsere Methode unempfindlich gegenüber DNA-Kontaminationen ist (die normalerweise zu falsch positiven Signalen führen) und daher keine vorherige Entfernung der Template-DNA erforderlich ist. Darüber hinaus schützt das Überspringen des DNA-Eliminierungsschritts die RNA wirksam vor dem Abbau. Auf diese Weise werden die beiden Hauptursachen für inhärente Ungenauigkeiten bei Transkriptomanalysen vermieden.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

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Vielen Dank an die Studenten, die im Labor gearbeitet haben, insbesondere an Nunzia Santini und Alessandro Esposito.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Kroatischen Wissenschaftsstiftung unterstützt: IP-2019-04-6915 an Ð. Ugarković und IP-2019-04-3790 an D. Đermić, sowie vom italienischen Ministerium für Bildung, Universität und Forschung (MIUR), FFABR2017, Fonds für Investitionen in die Grundlagenforschung (FIRB), vom International Staff Mobility Program von Universität Neapel Federico II bis I. Feliciello und von der ADRIS-Stiftung.

Abteilung für Molekularbiologie, Ruder-Boskovic-Institut, 10000, Zagreb, Kroatien

Damir Đermić, Sven Ljubić, Alfredo Procino und Đurđica Ugarković

Abteilung für Molekularbiologie, Fachbereich Biologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Zagreb, 10000, Zagreb, Kroatien

Maja Matulić

Institut für Statistikwissenschaft, Alma Mater Studiorum, Universität Bologna, 40126, Bologna, Italien

Maria Chiara Feliciello

Abteilung für klinische Medizin und Chirurgie, Universität Neapel Federico II, 80135, Neapel, Italien

Isidoro Feliciello

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IF: Konzeptualisierung, formale Analyse, Methodik, Validierung, Verfassen des Originalentwurfs. D.Đ., SL, MM: Probenvorbereitung, Rezension und Bearbeitung schreiben. AP und Đ.U.: Rezension schreiben und redigieren. MCF: Rezension schreiben und statistische Analyse.

Korrespondenz mit Đurđica Ugarković oder Isidoro Feliciello.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Đermić, D., Ljubić, S., Matulić, M. et al. Reverse Transkriptionsquantitative PCR (RT-qPCR) ohne vorherige DNA-Entfernung. Sci Rep 13, 11470 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38383-4

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Eingegangen: 05. April 2023

Angenommen: 07. Juli 2023

Veröffentlicht: 15. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38383-4

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