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Mar 23, 2024

CRISPR/Cas12a kombiniert mit RPA zum Nachweis von T. gondii im Vollblut von Mäusen

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 256 (2023) Diesen Artikel zitieren 280 Zugriffe 1 Altmetric Metrics Details Toxoplasma gondii ist ein opportunistisches Protozoon, das beim Menschen allgegenwärtig ist und

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 256 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Toxoplasma gondii ist ein opportunistisches Protozoon, das bei Menschen und Tieren allgegenwärtig ist. Es kann in jedes menschliche Organ eindringen und schwere Krankheiten verursachen, darunter Toxoplasmophthalmopathie, Meningoenzephalitis und Lebernekrose. Schweine-Toxoplasmose ist in China weit verbreitet. CRISPR-Systeme (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) und Cas-Systeme (CRISPR-Associated Protein) werden häufig zur Genbearbeitung und zum Nachweis von Krankheitserregern eingesetzt. Bei der CRISPR-basierten Diagnostik handelt es sich um molekulare Tests, die entwickelt wurden, um Parasiten mit hoher Sensitivität und Spezifität nachzuweisen.

Diese Studie zielte darauf ab, eine kombinierte CRISPR/Cas12a- und RPA-Schnellnachweismethode für T. gondii zu etablieren, indem sie auf das B1-Gen und das 529-bp-Wiederholungselement (529 RE) abzielte. Die Detektionsergebnisse können durch Fluoreszenz- oder Lateral-Flow-Streifen (LFS) visualisiert werden. Die Sensitivität und Spezifität der Methode wurden bewertet und mit T. gondii infiziertes Mäuseblut zum Nachweis verwendet.

Die Ergebnisse zeigten, dass die etablierte Methode zum Nachweis von T. gondii mit einer Nachweisgrenze von 1,5 cp/μl für die beiden Loci zufriedenstellend war. Darüber hinaus konnte das B1-Gen 1 Tachyzoiten pro Reaktion nachweisen, und das 529 RE konnte 0,1 Tachyzoiten pro Reaktion nachweisen, was im Einklang mit den Ergebnissen der hochempfindlichen Nested-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) steht. Die Methode war für Stämme, einschließlich RH, geeignet und führte zu keiner Kreuzreaktion mit der DNA anderer Protozoen mit ähnlichen Gewohnheiten. Die Blutproben der mit T. gondii infizierten Mäuse waren 1, 3 und 5 Tage nach der Infektion (dpi) alle positiv für T. gondii.

Diese Studie etablierte eine schnelle, empfindliche und zeitsparende DNA-Nachweismethode für T. gondii, die das Potenzial hat, ein alternatives Werkzeug für den Nachweis von T. gondii im Feld zu sein.

Toxoplasmose ist eine Mensch-Tier-Krankheit, die durch einen spezialisierten intrazellulären Parasiten, Toxoplasma gondii, verursacht wird und weltweit verbreitet ist [1]. Toxoplasma gondii gondii kann alle Warmblüter, auch den Menschen, infizieren [2]. Bei immunkompetenten Personen kann eine Infektion mit T. gondii grippeähnliche Symptome verursachen, die wochen- bis monatelang anhalten, bevor sie abklingen. Allerdings besteht bei immungeschwächten Personen, wie zum Beispiel bei Menschen mit erworbenem Immunschwächesyndrom (AIDS), bei älteren Menschen und bei Menschen, die immunsuppressive Medikamente einnehmen, ein höheres Risiko für schwere Erkrankungen und sogar den Tod nach einer T. gondii-Infektion [3]. Bei schwangeren Frauen, die mit T. gondii infiziert sind, besteht auch das Risiko einer angeborenen Toxoplasmose beim Fötus, die zu einer Reihe unerwünschter Folgen wie Abtreibung, Fehlbildung oder Totgeburt führen kann [4]. Berichten zufolge liegt die serologische positive Rate von T. gondii beim Menschen in einigen Regionen Chinas bei bis zu 23,41 %, was darauf hindeutet, dass die Infektion im Land weit verbreitet ist [5]. Zusätzlich zu seinen Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit hat T. gondii erhebliche Auswirkungen auf die Tierhaltung. Studien zeigen, dass die globale Seroprävalenz von T. gondii bei Schweinen 19 % beträgt [6]. Eine Infektion mit T. gondii bei Schweinen kann eine Reihe von Symptomen hervorrufen, darunter ausbleibendes Fieber, Durchfall, Lungenödem und Fehlgeburten bei Sauen. Da Schweinefleisch eine Hauptfleischquelle für den Menschen ist, erhöht Schweine-Toxoplasmose die Möglichkeit einer T. gondii-Infektion beim Menschen. Prävention und Screening auf T. gondii werden immer wichtiger. Das Fehlen spezifischer klinischer Symptome der Toxoplasmose stellt jedoch eine Herausforderung für die Diagnose dar und unterstreicht die Notwendigkeit der Entwicklung wirksamerer Methoden zum Nachweis von T. gondii.

Der Nachweis von Toxoplasma gondii gondii kann durch eine Vielzahl von Methoden erfolgen, darunter ätiologische, immunologische und molekulare Techniken. Ätiologische Methoden wie Abstriche der Bauchfellflüssigkeit und histologische Schnittfärbungen sind zeitaufwändig und weisen eine hohe Falsch-Negativ-Rate auf. Immunologische Tests wie der Enzymimmunoassay (ELISA) sind die gebräuchlichsten Methoden zum Nachweis von Toxoplasmose. Obwohl der ELISA einfach und schnell ist, kann es bei Patienten im Infektionsfenster passieren, dass sie übersehen werden, und es gibt verschiedene Störfaktoren, wie z. B. den Rheumafaktor [7]. Darüber hinaus können Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) und sekundärer Hypogammaglobulinämie aufgrund ihrer Unfähigkeit, IgG-Antikörper zu produzieren, falsch negative Ergebnisse liefern [8]. In der Molekularbiologie ist die PCR-Technologie am weitesten verbreitet. Burg et al. nutzten im 20. Jahrhundert erfolgreich die PCR-Technologie zum Nachweis von T. gondii-DNA aus Blut unter Verwendung des B1-Gens als Zielgen [9]. Die Verwendung konservierter Gene wie des P30-Gens und des SAG1-Gens war beim Nachweis von T. gondii erfolgreich [10, 11]. Quantitative PCR (Q-PCR) ist ein nützliches Derivat der PCR, das sowohl für qualitative als auch für quantitative Analysen verwendet werden kann. Allerdings erfordert die Q-PCR teure und präzise Instrumente, was ihren Einsatz auf das Labor beschränkt und sie für Feldanwendungen ungeeignet macht.

Neben der hohen Spezifität, der hohen Empfindlichkeit und dem kurzen Nachweisfenster sollte der ideale Erregernachweis auch die Portabilität und die geringen Kosten der Nachweisgeräte gewährleisten. In den letzten Jahren kam es zum Aufkommen isothermer Amplifikationstechniken wie der schleifenvermittelten isothermen Amplifikation (LAMP) und der Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) [12, 13] sowie der Entdeckung von Cas12a, Cas13a und Cas14 im CRISPR/Cas Familie [14,15,16], haben praktikable Ansätze für Point-of-Care-Tests (POCT) bereitgestellt. RPA kann eine exponentielle Amplifikation der Template-DNA in kurzer Zeit und in einer herkömmlichen Temperaturumgebung erreichen und die Abhängigkeit von PCR-Instrumenten beseitigen. Das CRISPR/Cas-System hat Potenzial für den Nachweis von Krankheitserregern gezeigt, wobei das Cas12a-System in der Lage ist, andere einzelsträngige DNA im System unspezifisch zu spalten, nachdem doppelsträngige DNA durch die crRNA, die auf die Zielsequenz abzielt, spezifisch gespalten wurde [17]. Im Jahr 2018 haben Doudna et al. etablierten das auf Cas12a basierende DNA-Endonuklease-gerichtete CRISPR-Transreportersystem (DETECTR), das zum schnellen Nachweis von Krankheitserregern wie SARS-CoV-2 und dem Afrikanischen Schweinepestvirus (ASFV) eingesetzt wurde [14, 18, 19]. Darüber hinaus wurden CRISPR-basierte Nachweismethoden zum Nachweis von Cryptosporidium parvum und Plasmodium eingesetzt [20,21,22], was auf das breite Potenzial von CRISPR beim Nachweis von Parasiten hinweist.

Das B1-Gen von T. gondii gilt mit 35 Kopien in der genomischen DNA des Parasiten heute als das am häufigsten verwendete Gen im Bereich des Nukleinsäurenachweises von T. gondii [7, 23, 24]. Ebenso wird angenommen, dass das 529 RE-Genfragment mit einer Wiederholungsrate von 200 bis 300 Kopien im T. gondii-Genom zur verbesserten Empfindlichkeit und Spezifität des Nachweises beiträgt [25]. In dieser Studie haben wir mithilfe der neu entwickelten DETECTR-Technologie eine molekulare Nachweismethode für das T. gondii B1-Gen und 529 RE entwickelt und deren Wirksamkeit mit der des Nested-PCR-Ansatzes verglichen. Die etablierte Methode wurde zum Nachweis der Blutproben von Wirtstieren verwendet. Wir zeigen, dass sich unsere Methode durch ein hohes Maß an Einfachheit, Geschwindigkeit und Genauigkeit auszeichnet und für Point-of-Care-Tests (POCT) geeignet ist, indem wir einfache Visualisierungstechniken verwenden, wie das Platzieren des Reagenzglases in einer dunklen Box unter UV-Licht in einem Außenumgebung oder Anwendung eines Lateral Flow Strip (LFS) zur direkten Ablesung der Ergebnisse mit bloßem Auge.

Die in der vorliegenden Untersuchung verwendeten Stämme RH, Pru, wh3 und wh6 wurden großzügigerweise vom Anhui Key Laboratory of Zoonoses der Anhui Medical University zur Verfügung gestellt. Die DNA von C. parvum und Babesia wurde vom Shanghai Veterinary Research Institute der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften bezogen. Darüber hinaus wurde Plasmodium von Chao Zhang von der Abteilung für Pathogenbiologie der Anhui Medical University erhalten. Sechs bis acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden vom Animal Experiment Center der Anhui Medical University gekauft.

Das Cas12a-Plasmid (pMBP-LbCas12a) wurde von Addgene erworben (Plasmid Nr. 113431). Expressionsvektoren, die N-terminale 10 × His-Tag-, MBP- und TEV-Protease-Spaltstellen enthielten, wurden in Rezeptorzellen Escherichia coli BL21 (DE3) transformiert. Die Zellen wurden in LB-Medium bei 37 °C bis zur logarithmischen Wachstumsphase kultiviert; 8 ml Zellen wurden zu 400 ml LB-Medium bei 16 °C und 200 U/min gegeben und über Nacht inkubiert. Dann wurden die Zellen gesammelt und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 % (v/v) Glycerin, 1 mM TCEP, 0,5 mM PMSF und 0,25 mg/ml Lysozym, pH 7,5) resuspendiert und lysiert Ultraschall. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation mit 10.000 rcf für 1 Stunde bei 4 °C entfernt. Der Proteinüberstand wurde nach der Zentrifugation mit einem 0,22-μm-Bakterienfilter filtriert. Das Filtrat wurde auf eine mit Ni-NTA-Reinigungsharz vorbeladene Säule (Sangon Biotech, Shanghai, China) gegeben und mit Puffer linear eluiert. Nach dem Halten über Nacht wurde eine TEV-Spaltung bei 4 °C durchgeführt, um den 10 × His-MBP-Tag zu entfernen, und die Probe wurde zur weiteren Reinigung in eine Heparinsäule (GE, Hi-Trap) geladen, um Cas12a-Protein zu erhalten. Der Puffer wurde durch die endgültige Aufbewahrungslösung für Cas12a (20 mM Tris-HCl, 2,0 M NaCl, pH 8,5) zur Proteinkonzentration durch ein Amicon® Ultra-4-Zentrifugalfiltrationsgerät (Millipore, China) ersetzt. Zur Konzentrationsbestimmung wurde die BCA-Methode verwendet, die Identifizierung erfolgte mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (Zusatzdatei 1: Abb. S1) mit Lagerung bei –20 °C.

Konservierte und spezifische T. gondii-Genomsequenzen wurden mithilfe des National Center of Biotechnology Information (NCBI) identifiziert, und die endgültige Auswahl fiel auf das T. gondii B1-Gen (GenBank: AF179871) und 529 RE (GenBank: AF146527) als Zielgene. Nachdem das Unternehmen 66 nt ssDNA-Oligonukleotid synthetisiert hatte (Zusatzdatei 1: Tabelle S1), wurde ssDNA-Oligonukleotid in vitro unter Verwendung des HiScribeT7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (NEB, USA) in ssRNA transkribiert. Das Transkriptionssystem bestand aus 10 μl NTP-Puffermix, 2 μl T7-RNA-Polymerase-Mix und 1 μg ssDNA-Oligonukleotid, und 20 μl wurden mit RNase-freiem Wasser erreicht. Die Inkubation erfolgte 7 Stunden lang bei 37 °C. Nach der Inkubation wurden 2 μl DNaseI zugegeben und Wasser hinzugefügt, um ein Volumen von 50 μl zu erreichen. Die DNA-Matrize wurde durch 15-minütige Inkubation bei 37 °C entfernt. Die resultierende crRNA wurde durch RNA-Reinigung mit dem Monarch® RNA Cleanup Kit (NEB, USA) erhalten. Bei allen Vorgängen sollte darauf geachtet werden, eine RNase-Kontamination zu verhindern. Das gereinigte Produkt wurde zur Konzentrationsbestimmung verwendet und vor der Verwendung zur Lagerung in einen kryogenen Kühlschrank mit −80 °C gegeben.

Die Suspension, die die Tachyzoiten von T. gondii RH enthielt, wurde 5 Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Toxoplasma gondii-DNA wurde mit dem TIANamp Genomic DNA Kit (Tiangen, China) extrahiert. Zielgene wurden durch PCR-Primer amplifiziert (Zusatzdatei 1: Tabelle S2) und mit einem DNA-Reinigungskit (Axygen, China) gereinigt. Das Reinigungsprodukt wurde durch TA-Klonierung in den T-Vector pMD19-Vektor eingefügt. Nach der Transformation in den DH5α-rezeptiven Zustand wurde die Extraktion mit dem Axygen Plasmid Small Volume DNA Extraction Kit (Axygen, China) durchgeführt. Die Konzentration wurde mit NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, USA) gemessen, aufgezeichnet und dann bei –20 °C gelagert.

Die DNA wurde extrahiert, nachdem 106 T. gondii-Tachyzoiten mit einer Zellzählplatte gezählt wurden, und die genomische DNA wurde mit ddH2O verdoppelt, um 105 Tachyzoiten-DNA pro Röhrchen auf 10–1 Tachyzoiten-DNA für nachfolgende Tests zu enthalten.

Für die isotherme Amplifikation von Nukleinsäuren wurde das RPA Nucleic Acid Amplification Kit (Hangzhou ZC, China) verwendet. Das gesamte Reaktionssystem für die Amplifikation betrug 50 μl; 41,5 μl Puffer-A-Lösung, jeweils 2 μl (10 μM) Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Zusatzdatei 1: Tabelle S3) und 2 μl Matrizen-DNA wurden zu einem RPA-Einheitsröhrchen gegeben, das lyophilisiertes Enzympulver enthielt; 2,5 μl Puffer-B-Lösung wurden in die Kappe gegeben. Der Deckel wurde abgedeckt, umgedreht und 5–6 Mal gemischt. Das Reaktionsröhrchen wurde 30 Minuten lang in 37 °C warmem Wasser gebadet, um ein Amplifikationsprodukt zu erhalten, das für nachfolgende CRISPR-Assays verwendet werden konnte.

Das für CRISPR-Reaktionen benötigte Metall-PCR-Röhrchengestell wurde vorab in einem Kühlschrank auf −80 °C vorgekühlt, woraufhin das folgende System auf dem gekühlten PCR-Röhrchengestell vorbereitet wurde: 1 μM LbCas12a, 2,5 μM crRNA und 2 μl 10 × NEB-Puffer 2,1 und schließlich wurden 20 μl mit RNase-freiem Wasser aufgefüllt. Nach einer zehnminütigen Inkubation bei 37 °C folgte die Zugabe von 0,5 μM DNA-Fluoreszenzsonde (5'-FAM-TTATTATT-Bio-3'). Zu 18 μl des obigen Reaktionssystems wurden 2 μl RPA-Amplifikationsprodukt hinzugefügt und die Fluoreszenz am FAM-Kanal mit BioRad CFX96 überwacht, um den Fluoreszenzwert abzulesen.

2 μl der fertigen voramplifizierten Probe wurden abgesaugt und dem CRISPR/Cas12a-Spaltungsreaktionssystem hinzugefügt. 20 μl des Reaktionssystems wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurden 80 μl 1 × PBS hinzugefügt und gut gemischt; 100 μl wurden auf das Probenkissen aufgesaugt und die Ergebnisse nach 5–10 Minuten bei Raumtemperatur beobachtet.

Die verschachtelten PCR-Primer (Zusatzdatei 1: Tabelle S4) wurden wie im Artikel von Shirzad Fallahi et al. beschrieben verwendet. [26]. Die Länge des verschachtelten PCR-Produkts betrug 194 bp für das B1-Gen und 164 bp für das 529 RE. Die erste Runde des PCR-Reaktionssystems bestand aus 50 µl und enthielt 10 µl 5 × PrimeSTAR-Puffer, 4 µl dNTP-Mix, jeweils 1 µl (10 µM) Upstream- und Downstream-Primer, 1 µl DNA-Matrize, 1 µl Taq-DNA-Polymerase und 50 µl µl mit ddH2O aufgefüllt.

Das Amplifikationsverfahren war wie folgt: Die anfängliche Denaturierung erfolgte 5 Minuten lang bei 95 °C, gefolgt von 34 Denaturierungszyklen (10 Sekunden bei 98 °C), Annealing (15 Sekunden bei 56 °C) und Verlängerung (60 Sekunden/Minute). kb bei 72 °C), am Ende des Zyklus 5 Minuten lang bei 72 °C verlängert. Die Produkte der ersten Runde wurden als Vorlage der zweiten Runde in das System der zweiten Runde übernommen, wobei die Vorgehensweise dieselbe war wie in der ersten Runde. Die Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht.

Die Zählung erfolgte mit einer Zellzählplatte. Jeder Maus wurden 1000 Tachyzoiten injiziert, und der Kontrollgruppe wurde das gleiche Volumen Kochsalzlösung injiziert. Fünf Mäuse aus jeder Gruppe wurden für die Augenblutentnahme bei 1, 3 und 5 dpi ausgewählt, und Kontrollmäuse wurden am letzten Tag seziert und getötet. Das Blut musste gerinnungshemmend behandelt werden. Anschließend wurden 200 µl gerinnungshemmendes Blut zum Testen entnommen, wobei Proben aus der Kochsalzlösungsgruppe als Negativkontrolle dienten. Die Verwendung von Tieren wurde von der Ethikkommission für Versuchstiere der Anhui Medical University genehmigt.

In dieser Studie haben wir eine Schnellerkennungsmethode für T. gondii-Infektionen entwickelt, indem wir RPA und CRISPR/Cas12a kombinierten (Abb. 1a). Die Methode umfasst drei einfache Schritte: Nukleinsäureextraktion, RPA-Amplifikation und CRISPR/Cas12a-spezifischer Nachweis. Um die Empfindlichkeit der Nachweismethode für T. gondii zu erhöhen, führten wir einen Vergleich von Zielen, ein Screening von Primern und eine Systemoptimierung durch. Für die B1- und 529-RE-Ziele haben wir jeweils drei crRNAs entworfen und ihre Leistung im DETECTR-System durch Bewertung der Fluoreszenzintensität bewertet. Letztendlich haben wir B1-L3 und 529 RE-L3 zum Nachweis von T. gondii ausgewählt (Abb. 1b). Um die effizientesten Primer für die RPA-Amplifikation zu identifizieren, haben wir für jeden Locus drei Vorwärts- und Rückwärtsprimer entworfen. Wir haben die Vorwärtsprimer fixiert, um die optimalen Rückwärtsprimer herauszufiltern, und auf ähnliche Weise die Vorwärtsprimer herausgefiltert (Abb. 1c, d). Wir optimierten das System durch Anpassen der Konzentration von Protein und crRNA und stellten fest, dass der beste Nachweiseffekt erzielt wurde, wenn die Endkonzentration des Proteins 5 μM und die Endkonzentration der crRNA 10 μM betrug. Um die Testkosten zu senken, haben wir uns für die Verwendung einer Cas12a-Endkonzentration von 1 μM und einer crRNA-Endkonzentration von 2,5 μM entschieden, die in nachfolgenden Experimenten verwendet wurden (Abb. 1e).

Etablierung von CRISPR/Cas12a kombiniert mit RPA zum Nachweis von Toxoplasma gondii. ein DETECTR-Workflow von T. gondii. b Vergleich verschiedener crRNAs, die auf B1 und 529 RE abzielen, mittels Fluoreszenzassay. c Screening von RPA-Primern für B1-L3. d Screening von RPA-Primern auf 529 RE-L3. e Optimierung der Konzentration von Cas12a und crRNA

Wir haben die Nachweisgrenze des DETECTR-Assays für T. gondii unter Verwendung rekombinanter Plasmide bewertet und festgestellt, dass die Nachweisempfindlichkeit für das B1-Gen und 529 RE-Loci nur 1,5 cp/μl betrug (Abb. 2a, b). Bemerkenswerterweise emittierten positive Proben unter UV-Strahlung eine starke gelbgrüne Fluoreszenz, die mit bloßem Auge sichtbar war, was diese Methode besonders für den Einsatz in ressourcenbeschränkten Umgebungen geeignet macht (Abb. 2a, b).

Empfindlichkeit des DETECTR-Systems: (a) B1-DETECTR- und (b) 529 RE-DETECTR-Reaktion mit Plasmidstandards. Die Röhre zeigt das Fluoreszenzsignal der Probe unter UV-Licht. 1–8 repräsentieren 3000 cp/μl, 300 cp/μl, 30 cp/μl, 3 cp/μl, 1,5 cp/μl, 0,3 cp/μl, 0,03 cp/μl, Negativkontrolle. c B1-DETECTR- und d529 RE-DETECTR-Reaktion mit T. gondii-Tachyzoiten-DNA. e B1-nested PCR und f 529 RE-nested PCR-Reaktion mit T. gondii-Tachyzoiten-DNA. 1–7 repräsentieren 10.000, 1.000, 100, 10, 1, 0,1, 0,01 Tachyzoiten-DNA pro Reaktion. ****P < 0,0001; ns, nicht signifikant

Wir haben den DETECTR-Assay weiter mit Reihenverdünnungen von Tachyzoiten-DNA getestet und festgestellt, dass die Nachweisgrenze bei 1 Tachyzoit pro Reaktion für B1 (Abb. 2c) und 0,1 Tachyzoit pro Reaktion für 529 RE (Abb. 2d) lag; 529 RE war empfindlicher als B1, möglicherweise weil 529 RE 200–300 Kopien im T. gondii-Genom aufweist, während das B1-Gen nur 35 Kopien aufweist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der DETECTR-Assay mit der Nested-PCR vergleichbar ist, da beide Methoden 1 Tachyzoiten pro Reaktion für B1 nachweisen konnten (Abb. 2e), während 529 RE 0,1 Tachyzoiten pro Reaktion nachweisen konnte (Abb. 2f). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der DETECTR-Assay eine empfindliche und zuverlässige Methode zum Nachweis von T. gondii-Tachyzoiten-DNA ist, insbesondere wenn er auf den 529 RE-Locus abzielt.

Um die Universalität des DETECTR-Assays für T. gondii zu untersuchen, haben wir die aus vier verschiedenen Stämmen extrahierte DNA nachgewiesen, darunter RH in Typ I, Pru in Typ II und die Stämme wh3 und wh6 des chinesischen 1-Genotyps. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Methode für alle vier Stämme wirksam war und starke Fluoreszenzwerte aufwies, und dass es keinen signifikanten Unterschied in der Detektionswirkung zwischen den vier Stämmen gab (Abb. 3a, b).

Spezifität des DETECTR-Systems: (a) B1-DETECTR- und (b)529 RE-DETECTR-Reaktion der DNA von vier verschiedenen Stämmen von T. gondii; alle vier Stämme können nachgewiesen werden. NC, Negativkontrolle. c B1-DETECTR- und d529 RE-DETECTR-Reaktion von vier Arten von Parasiten-DNA, mit Ausnahme der DNA von T. gondii, konnte nicht nachgewiesen werden. NC, Negativkontrolle; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns, nicht signifikant

Darüber hinaus haben wir für den spezifischen Nachweis Plasmodium, C. parvum und Babesia ausgewählt, die ähnliche Gewohnheiten oder Infektionssymptome wie T. gondii aufweisen. Das DETECTR-System für T. gondii zeigte nur für T. gondii-DNA eine positive Wirkung, und die Fluoreszenzwerte der anderen drei Protozoen stimmten mit denen der negativen Kontrollgruppe überein (Abb. 3c, d). Dieses Ergebnis war auch unter UV-Licht sichtbar (Zusatzdatei 1: Abb. S2). Daher zeigte das DETECTR-System eine gute Spezifität.

Wir haben ein Mausmodell für Toxoplasmose entwickelt, indem wir BALB/c-Mäusen 1000 RH-Tachyzoiten intraperitoneal verabreicht haben. Wir verwendeten das DETECTR-System, um einen schnellen Nachweis von T. gondii in Vollblutproben infizierter Mäuse durchzuführen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass T. gondii-DNA in allen Blutproben mit 1, 3 und 5 dpi erfolgreich nachgewiesen werden konnte, während die mit Kochsalzlösung injizierte Negativkontrollgruppe negative Ergebnisse lieferte (Abb. 4a, c). Eine verschachtelte PCR wurde auch an Blutproben von Mäusen durchgeführt, die mit 1000 RH-Tachyzoiten infiziert waren, und alle Proben waren bei 1, 3 und 5 dpi positiv, während alle Proben in der Kontrollgruppe negativ waren (Abb. 4b, d). Unsere Studie zeigt, dass das DETECTR-System in der Lage ist, eine T. gondii-Infektion im Frühstadium zu erkennen.

Analyseergebnisse von Blutproben von mit Toxoplasma gondii infizierten Mäusen. eine B1-DETECTR- und c 529 RE-DETECTR-Reaktion mit Mäuseblut-DNA. 1 dpi, 1 Tag nach der Infektion Mäuse Nr. 1; NS-1, normale Kochsalzlösung Nr. 1; PC, Positivkontrolle; NC, Negativkontrolle; b B1-nested PCR und d 529 RE-nested PCR-Reaktion mit Mausblut-DNA. 1–15 stellen Blutproben von Mäusen dar, die 1, 3, 5 Tage nach der Injektion entnommen wurden; 16–20 stellen Proben nach der Injektion von Kochsalzlösung dar; 21 stellt eine positive Kontrolle dar; 22 stellt eine Negativkontrolle dar

In dieser Studie haben wir das CRISPR/Cas12a-basierte DETECTR-Nachweissystem mit LFS kombiniert, um Ziel-DNA zu erkennen. Die LFS-Technologie [27] nutzt das Prinzip der Sandwich-Immunchromatographie, um das Vorhandensein von Ziel-DNA in einer Probe nachzuweisen (Abb. 5a). Insbesondere umfasst das LFS einen Probenbindungsbereich, eine Testlinie und eine Kontrolllinie. An Goldnanopartikel gekoppelte FITC-Antikörper werden in der Probenbindungsregion immobilisiert, die Testlinie wird mit Streptavidin markiert und die Kontrolllinie wird mit Anti-FITC-Antikörpern markiert. Nach Zugabe des Reaktionssystems kann das ssDNA-Reportermolekül (FITC-TTATTATT-Biotin) als Komplex an den mit Goldnanopartikeln gekoppelten FITC-Antikörper binden. Handelt es sich um eine negative Probe, wird der Komplex an der Testlinie eingefangen und beide Linien werden angezeigt; Handelt es sich um eine positive Probe, wird Cas12a aktiviert und spaltet das Reportermolekül, der Komplex wird nicht von der Testlinie erfasst; Es wird nur die Kontrolllinie angezeigt. Wenn keine oder nur die Testlinie angezeigt wird, weist dies darauf hin, dass der Vorgang fehlerhaft war oder der Teststreifen ausgefallen ist, sodass die Ergebnisse nicht aussagekräftig sind. Insgesamt stellt die entwickelte Methode ein vielversprechendes Werkzeug für den tragbaren Nachweis von Ziel-DNA in verschiedenen Umgebungen dar.

DETECTR-basierter LFS-Nachweis von T. gondii. ein Prinzip von LFS. b B1-LFS- und c 529 RE-LFS-Reaktion mit Spezifitätserkennung. 1–5 repräsentieren Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, Babesia, Plasmodium, Negativkontrolle. d B1-LFS- und e 529 RE-LFS-Reaktion mit Mäuseblut-DNA. 1–5 stehen für 5 Tage nach der Injektion; 6–8 stellen Proben nach der Injektion von Kochsalzlösung dar; 9 stellt die Positivkontrolle dar, 10 stellt die Negativkontrolle dar

In dieser Studie haben wir die Sensitivität und Spezifität der LFS-Nachweismethode zur Diagnose einer T. gondii-Infektion mithilfe des CRISPR-basierten Nachweissystems bewertet. Konkret haben wir die amplifizierten Proben mit einem CRISPR-Nachweissystem gemischt und eine Stunde lang inkubiert, bevor wir das LFS durchgeführt haben. Anschließend führten wir einen Spezifitätstest mit dem LFS durch und stellten fest, dass es keine Kreuzreaktivität mit anderen Parasiten gab, was auf die hohe Spezifität der Methode hinweist (Abb. 5b, c). Darüber hinaus haben wir das LFS verwendet, um T. gondii in Vollblutproben von fünf Mäusen auf dem 5-dpi-Gerät nachzuweisen. Bemerkenswerterweise waren alle Proben positiv für T. gondii und die Ergebnisse stimmten mit der Fluoreszenzdetektion überein (Abb. 5d, e). Diese Ergebnisse zeigten insgesamt, dass die LFS-Nachweismethode eine gute Sensitivität und Spezifität für den Nachweis von T. gondii aufwies und als vielversprechendes Instrument für die genaue Diagnose einer T. gondii-Infektion eingesetzt werden kann.

Bisher gibt es kein wirksames therapeutisches Medikament für eine T. gondii-Infektion. Daher ist die Entwicklung einer schnellen und genauen Nachweismethode für diesen Krankheitserreger von entscheidender Bedeutung für die Krankheitsbekämpfung und die Verhinderung seiner Ausbreitung. In dieser Studie haben wir einen neuartigen Ansatz zum Nachweis von T. gondii entwickelt, der RPA- und CRISPR/Cas12a-Technologie kombiniert und Fluoreszenz oder LFS als Meldemethode verwendet. Wir führten eine vergleichende Analyse der Wirksamkeit von Nested-PCR- und DETECTR-Assays für B1 bzw. 529 RE durch. Die Ergebnisse zeigten, dass DETECTR eine mit der Nested-PCR vergleichbare Sensitivität und Spezifität bot, jedoch aufgrund des Fehlens komplexer technischer Anforderungen benutzerfreundlicher war. Die DETECTR-Reaktion wurde bei einer konstanten Temperatur von 37 °C durchgeführt, und der gesamte Prozess erforderte kein komplexes technisches Fachwissen, was den sofortigen Nachweis von T. gondii-DNA vor Ort innerhalb kurzer Zeit ermöglichte.

Derzeit umfassen Nukleinsäure-Nachweismethoden zur Identifizierung von Krankheitserregern hauptsächlich drei Hauptschritte: Probenverarbeitung, Nukleinsäureamplifikation sowie Signaltransduktion und -berichterstattung. Herkömmliche Amplifikationsmethoden wie PCR und Q-PCR sind zeitaufwändig, dauern bis zu 2 Stunden oder sogar länger und erfordern Temperaturzyklen. Obwohl es sich bei LAMP um eine Amplifikationsmethode bei konstanter Temperatur handelt, ist ihr Primerdesign komplex und die Amplifikationsreaktion erfordert eine einstündige Inkubation bei 65 °C [28]. Im Gegensatz dazu ist das RPA-Primerdesign einfach und die Amplifikationsreaktion kann bei 37 °C nur 20–30 Minuten lang durchgeführt werden. Darüber hinaus kann das CRISPR/Cas12a-Transspaltungssystem bei 37 °C aktiviert werden und die gesamte Reaktion kann in einem Wasserbad, einem Inkubator mit konstanter Temperatur oder sogar in der Handfläche durchgeführt werden. Die Ergebnisse können unter UV-Licht oder durch die Verwendung von Lateral-Flow-Streifen abgelesen werden, was die Erkennung auch in Nicht-Laborumgebungen erleichtert.

In dieser Untersuchung wurden B1 und 529 RE aufgrund ihrer häufigen Verwendung beim Nukleinsäurenachweis von T. gondii als Ziele ausgewählt. Bei der Erkennung der doppelsträngigen Ziel-DNA wurde das CRISPR/Cas12a-System aktiviert, was zu einer massiven Spaltung des einzelsträngigen DNA-Reporters führte, der als Signalwandler für die Umwandlung der Ziel-dsDNA-Erkennung in die Fluoreszenz- oder LFS-Banden diente [29]. , 30]. Die Kombination aus RPA-Verstärkungseffekt und DETECTR-Technologie führt zu einem hochempfindlichen Nachweis von T. gondii-DNA.

Die Empfindlichkeit von DETECTR-Assays für den Nachweis seriell verdünnter rekombinanter Plasmide kann 1,5 cp/μl erreichen. Für T. gondii-Tachyzoiten-DNA kann DETECTR mindestens 1 Tachyzoiten durch das B1-Gen (35 Kopien) und 0,1 Tachyzoiten durch 529 RE (200–300 Kopien) erkennen, wobei 529 RE eine bessere Wahl als B1 ist, wie von Shirzad Fallahi bestätigt und Kollegen [26]. Bemerkenswert ist, dass die hohe Empfindlichkeit der Nested PCR [31] für den T. gondii-DNA-Nachweis mit der von DETECTR vergleichbar ist, was darauf hindeutet, dass die DETECTR-Technologie geringe Konzentrationen von T. gondii in der Umwelt identifizieren kann. Darüber hinaus konnte DETECTR bei der Auswertung von Vollblutproben von Mäusen positive Proben auf 1 dpi erkennen und infizierte von nicht infizierten Proben unterscheiden. Die von uns entwickelte Methode dient hauptsächlich dem Nachweis von Wirtsblutproben; Die Entnahme von Blutproben ist im Gegensatz zu Gewebeproben, die dem Wirt schaden können, ein minimalinvasiver oder sogar nicht-invasiver Prozess. Diese Methode hat das Potenzial, ein frühes und leistungsstarkes Diagnosewerkzeug für T. gondii-DNA zu sein.

Die Validierung der Spezifität des DETECTR-Assays für den Nachweis von T. gondii wurde durch die Analyse der DNA von Plasmodium, C. parvum und Babesia durchgeführt, bei denen es sich um Parasiten handelt, die entweder eine ähnliche Entwicklung wie T. gondii (C. parvum) aufweisen oder vorhanden sein können in Blutproben (Plasmodium, Babesia). Bemerkenswerterweise waren alle Ergebnisse für diese Parasiten mit Ausnahme von T. gondii negativ, was die hohe Spezifität des DETECTR-Assays für den Nachweis von T. gondii bestätigt.

Zusammenfassend ist DETECTR eine unkomplizierte und schnelle Methode zum Nachweis von T. gondii, die mit begrenzten Ressourcen auf verschiedene Umgebungen angewendet werden kann. Zusätzlich zum Nachweis infizierter Tiere kann auch der Nachweis von T. gondii-DNA in der Umwelt durchgeführt werden, was als Alternative zu aktuellen Nachweismethoden großes Potenzial hat. Zusätzlich zu den oben genannten Vorteilen weist DETECTR einige Einschränkungen in der DNA-Extraktionsphase auf. Es wurde gezeigt, dass CRISPR-basierte Nukleinsäure-Nachweissysteme mit Methoden kompatibel sind, die Nukleinsäuren schnell freilegen, wie etwa Erhitzen oder chemische Lyse [32]. Daher konzentrierte sich die anschließende Forschung auf die Entwicklung von Techniken zur schnellen Freisetzung von T. gondii-DNA aus Proben, ohne die Nachweisempfindlichkeit zu beeinträchtigen und so die Nachweiszeit weiter zu verkürzen. Da zwischen T. gondii-Stämmen unterschiedliche Gene existieren [33], die zu Variationen in der Virulenz und Pathogenität führen, basieren aktuelle Typisierungsmethoden auf Sequenzierung und einigen PCR-abgeleiteten Techniken [34, 35]. Stammspezifische sgRNAs können für das CRISPR-Targeting entworfen werden, was besonders nützlich für die Identifizierung und Typisierung von T. gondii-Genen sein kann. Zusätzlich zu ihrem Nutzen bei der Erkennung von T. gondii verspricht die DETECTR-Technologie große Chancen für breitere Anwendungen in der T. gondii-Forschung.

Die in der Studie vorgestellten Originalbeiträge sind im Artikel/Ergänzungsmaterial enthalten; Weitere Anfragen können an den Autor Xiaofeng Wang gerichtet werden: [email protected].

Gehäufte, regelmäßig beabstandete kurze palindromische Wiederholungen

CRISPR-assoziiertes Protein

529 bp Wiederholungselement

Polymerase Kettenreaktion

Erworbenes Immunschwächesyndrom

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Chronischer lymphatischer Leukämie

Quantitative PCR

Schleifenvermittelte isotherme Verstärkung

Rekombinase-Polymerase-Amplifikation

Auf DNA-Endonuklease ausgerichteter CRISPR-Trans-Reporter

Point-of-Care-Tests

Nationales Informationszentrum für Biotechnologie

Seitlicher Strömungsstreifen

Tag nach der Infektion

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Referenzen herunterladen

Wir danken Li Yu vom Anhui Key Laboratory of Zoonoses der Anhui Medical University für die Bereitstellung des Toxoplasma gondii. Wir danken dem Shanghai Veterinary Research Institute der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften für die Bereitstellung von DNA von Cryptosporidium parvum und Babesia. Wir danken Chao Zhang von der Abteilung für Pathogenbiologie der Anhui Medical University für die Bereitstellung des Plasmodiums.

Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (2021YFC2301100) unterstützt.

Xiaofeng Wang und Miao Cheng haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Das Schlüssellabor für Mikrobiologie und Parasitologie der Provinz Anhui, das Schlüssellabor für Zoonosen an höheren Institutionen in Anhui, Abteilung für Pathogenbiologie, School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, Hefei, China

Xiaofeng Wang, Miao Cheng, Shuqi Yang, Chen Xing, Qian Li, Yating Zhu und Yinan Du

School of Basic Medical Sciences, Abteilung für Biowissenschaften und Medizin, Universität für Wissenschaft und Technologie Chinas, Hefei, China

Yongsheng Ji

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Gestaltung der Arbeit: XW, CX, YJ, YD. Erfassung und Analyse der Daten: XW, MC, SY, QL, YZ. Verfassen des Originalmanuskripts: XW. Betreuung des Projekts: YJ, YD. Finanzierungseinwerbung: YD. Alle Autoren haben zum Artikel beigetragen und die eingereichte Version genehmigt.

Korrespondenz mit Yongsheng Ji oder Yinan Du.

Alle Tierversuche in dieser Studie wurden von der Ethikkommission für Labortiere der Anhui Medical University genehmigt (Genehmigungsnummer LLSC20221092).

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Proteinexpression und -reinigung. Mit Coomassie-Blau gefärbtes Acrylamidgel. Abbildung S2. Spezifität der DETECTR-Reaktion. Die linke Röhre stellt B1-L3 dar; Die rechte Röhre repräsentiert 529 RE-L3. Tabelle S1. ssDNA-Oligonukleotidsequenzen. Tabelle S2. PCR-Primer zur Erstellung von Standards. Tabelle S3. RPA-Primer. Tabelle S4. Verschachtelte PCR-Primer

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, X., Cheng, M., Yang, S. et al. CRISPR/Cas12a kombiniert mit RPA zum Nachweis von T. gondii im Vollblut von Mäusen. Parasites Vectors 16, 256 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05868-0

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Eingegangen: 18. April 2023

Angenommen: 04. Juli 2023

Veröffentlicht: 30. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05868-0

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