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Jan 12, 2024

PCR

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1520 (2023) Diesen Artikel zitieren 2265 Zugriffe auf 2 Altmetric Metrics-Details Hochempfindliche Schnelltests für COVID-19 sind für die Minimierung von Viren unerlässlich

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1520 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Hochempfindliche Schnelltests auf COVID-19 sind unerlässlich, um die Virusübertragung zu minimieren, insbesondere vor dem Auftreten von Symptomen und in asymptomatischen Fällen. Hier berichten wir über biotechnologisch hergestellte Anreicherungswerkzeuge für Lateral-Flow-Assays (LFAs) mit erhöhter Empfindlichkeit und Spezifität (BEETLES2), die eine Anreicherung von SARS-CoV-2-Viren, Nukleokapsid (N)-Proteinen und Immunglobulin G (IgG) in einem 3-Minuten-Betrieb erreichen. Die Nachweisgrenze wird um das 20-fache verbessert. Wir wenden diese Methode auf klinische Proben an, darunter 83 % mit mittlerer (35 %) oder niedriger Viruslast (48 %), die von 62 Personen entnommen wurden (n = 42 für positive und n = 20 für gesunde Kontrollpersonen). Wir beobachten eine diagnostische Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit von 88,1 %, 100 % bzw. 91,9 %, verglichen mit kommerziellen LFAs allein, die 14,29 %, 100 % bzw. 41,94 % erreichen. BEETLES2 kann mit Permselektivität und Abstimmbarkeit das SARS-CoV-2-Virus, N-Proteine ​​und IgG im nasopharyngealen/oropharyngealen Abstrich, im Speichel und im Blutserum anreichern und so zuverlässige und empfindliche Point-of-Care-Tests ermöglichen, die eine schnelle Frühdiagnose ermöglichen .

Schnelles Screening und Testen auf COVID-19 ermöglicht die Identifizierung infizierter Personen mit hohem Risiko und reduziert folglich die Virusausbreitung, was zu einer besseren Prävention und Kontrolle von COVID-191,2 führt. Eine schnelle Erkennung und Behandlung mit angemessener Quarantäne sind die besten Strategien zur Bewältigung von Pandemien. Für kommerzielle Schnelltests auf COVID-19 stehen 59 Antigen-Diagnosetests auf SARS-CoV-2 im Rahmen einer Notfallzulassung (Emergency Use Authorization, EUA) zur Verfügung (Stand 1. Januar 2023)3. Ungeachtet der entwickelten Techniken mit fortschrittlicher diagnostischer Leistung4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 gelten RT-qPCR-Tests (Reverse Transcription-Quantitative Polymerase Chain Reaction) immer noch als Goldstandard für COVID-19 Diagnose. Obwohl mithilfe von RNA-Nachweistechnologien ein hochempfindlicher Assay durchgeführt werden kann, sind häufige Vor-Ort-Tests auf COVID-19 eine Herausforderung. RT-qPCR ist mit hohen Kosten, einer langen Betriebszeit (4–6 Stunden) und langen Durchlaufzeiten (bis zu mehreren Tagen) verbunden14,15,16,17. Darüber hinaus erfordert die hochempfindliche und selektive RT-qPCR-Technik teure Laborausrüstung und umständliche RNA-Extraktionsschritte, was ihre Anwendung in Point-of-Care-Tests (POCTs) einschränkt18. Lange Bearbeitungszeiten ermöglichen es den infizierten Personen, das Virus exponentiell zu verbreiten, bevor Ergebnisse erzielt werden, wodurch die Auswirkungen der Isolierung und Kontaktverfolgung begrenzt werden8,19. Wichtig ist, dass asymptomatische Menschen das Virus auf Gemeinschaften übertragen, die eine ähnliche Viruslast haben wie diejenigen, die Symptome entwickeln20.

Um die Ausbreitung von COVID-19 einzudämmen, ist die schnelle und einfache Erkennung vor Ort zu Beginn der Infektion der beste Ansatz, um die weitere Ausbreitung mithilfe von Hochfrequenztests zu stoppen. Im Gegensatz zur routinemäßig getesteten RT-qPCR sollte der Hochfrequenztest kostengünstig und am Behandlungsort möglich sein. Mina et al. hat behauptet, dass der beste COVID-19-Filter durch häufige, kostengünstige, einfache und schnelle Tests erreicht werden kann, da SARS-CoV-2 schnell wächst und sich exponentiell ausbreitet19. Ein einmalig überwachter hochempfindlicher RT-qPCR-Test kann die Virusausscheidung lange nach der Infektionsperiode (etwa 9 Tage) nachweisen, bis zu 17 Tage21, also im Rekonvaleszenzstadium mit geringerer Übertragung.

Im Hinblick auf Hochfrequenztests für dezentrale lokale Tests hat sich die Lateral-Flow-Assay-Plattform (LFA) als die beste Plattform für Point-of-Care- und Selbsttests erwiesen, da sie praktische, benutzerfreundliche, einstufige Einwegtests ermöglicht und schnelle Ergebnisse22. Die LFA-Plattformen gelten als die besten Kandidaten, da sie die „ASSURED“-Kriterien der WHO (Weltgesundheitsorganisation) erfüllen (erschwinglich, empfindlich, spezifisch, benutzerfreundlich, schnell und robust, ohne Ausrüstung und für Endbenutzer lieferbar)23. Die geringere LFA-Leistung schränkt die Genauigkeit ein, erhöht die Zahl falsch negativer Ergebnisse und erschwert die Frühdiagnose von COVID-19. Im Allgemeinen zeigt die LFA-Plattform eine gute Genauigkeit für hohe Viruslasten; Allerdings nimmt die Genauigkeit bei geringer Viruslast abrupt ab. Darüber hinaus sind immunoassaybasierte LFA-Tests weniger empfindlich als molekularbasierte RT-qPCR, was zu mehr falsch-negativen Ergebnissen führt und das Risiko einer Weiterübertragung des Virus erhöht. Kürzlich haben Chen et al. berichteten über einen quantitativen und hochempfindlichen In-situ-Immunoassay unter Verwendung einer nanoporösen anodischen Aluminiumoxidmembran (AAO), der die Fähigkeit zur Anreicherung von SARS-CoV-2-Viren zeigte9. Im Allgemeinen gelten AAO-Membranen als vielversprechendes Material zur Erleichterung der größenbasierten Trennung und Anreicherung24,25,26.

Hier entwickeln wir biotechnologisch hergestellte Anreicherungstools für LFA mit erhöhter Sensitivität und Spezifität (BEETLES2) in Kombination mit einem kommerziellen COVID-19-LFA-Kit. Eine Schlüsselkomponente von BEETLES2 ist eine permselektiv abstimmbare Nanofalle, die die klinische Leistung kommerzieller LFA verbessern kann. Wir bereiten BEETLES2 mit einer Kombination aus roten Blutkörperchenmembranen (RBCMs) und nanoporösem anodischem Aluminiumoxid (AAO) vor. Die Kombination aus hohem AAO-Fluss und einem Aquaporin (AQP)-Wasserkanal ermöglicht im Gegensatz zur größenbasierten AAO-Membrananreicherung27,28 einen schnellen Wassertransport mit zusätzlicher Permselektivität innerhalb von 3 Minuten und erreicht so eine Anreicherung von SARS-CoV-2-Viren, Nukleokapsid (N). Proteine ​​und Immunglobulin G (IgG)-Antikörper. Die Nachweisgrenze (LOD) wird um das 20-fache erhöht. Darüber hinaus zeigen wir eine verbesserte diagnostische Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit bei der Anwendung auf Patientenproben.

Wir demonstrieren das Schlüsselkonzept von BEETLES2, das Biomoleküle nach Größe und Ladung anreichert und trennt, und seine Anwendung für Immun- und Molekulartests (Abb. 1). Ein Hybridfilter bestehend aus RBCM auf einer AAO-Membran wird als BEETLES2-Membran bezeichnet. In den folgenden Abschnitten beschreiben wir weitere Details zur permselektiven einstellbaren Anreicherung von BEETLES2 mit verschiedenen Kriterien wie Größe, Ladung und Druck. Abbildung 1a zeigt einen Prototyp für die POCT-Probenvorbereitung (Details in Abb. S1). Ausgestattet mit der BEETLES2-Membran haben wir die Zielproben angereichert und die Tests für POCT und molekulare Diagnostik verbessert. Bei COVID-19-Anwendungen haben wir uns auf die Anreicherung von N-Proteinen, SARS-CoV-2-Viren und IgG-Antikörpern konzentriert. Das N-Protein, eines der vier Strukturproteine ​​des SARS-CoV-2-Virus, ist das Zielprotein für die meisten COVID-19-Ag-LFAs. Die IgG-Antikörper sind die Zielmoleküle für COVID-19 Ab LFA. Abbildung 1b zeigt das Testprotokoll von der Probenahme bis zum Test. Nach der Probenentnahme haben wir das Zielmolekül über BEETLES2 angereichert, ein etabliertes Diagnosetool wie kommerzielles LFA und RT-qPCR angewendet und die Testleistung verbessert (Ergänzungsvideo). Da BEETLES2 N-Proteine, SARS-CoV-2-Viren und IgG-Antikörper anreichern kann, ermöglicht die BEETLES2-unterstützte LFA die tägliche Überwachung von Infektionskrankheiten.

Ein BEETLES2, ein Hybridfilter bestehend aus RBCM auf einer AAO-Membran, verfügt über Permselektivität und Abstimmbarkeit, die die Anreicherung von Biomolekülen mit einer Trennfunktion ermöglichen. b Assay mit BEETLES2 für Immunoassay und Molekularassay. Cartoons in den Panels a, b wurden mit BioRender.com erstellt. BEETLES2, biotechnologisch hergestellte Anreicherungswerkzeuge für die LFA mit erhöhter Empfindlichkeit und Spezifität. Anodisches AAO-Aluminiumoxid, LFA-Lateral-Flow-Assay, quantitative RT-qPCR-Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion, RBCM-Membran roter Blutkörperchen.

Der Hauptvorteil von BEETLES2 besteht darin, dass das Virusprotein und das Virus selbst unter verschiedenen Puffern angereichert werden können, darunter phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Speichel, Serum und Virustransportmedium (VTM). Darüber hinaus können reichlich vorhandenes Protein (Albumin) und kleine Hemmstoffe eliminiert werden. Größere Biomoleküle wie IgG (~150 kDa) werden angereichert, da größere Proteine ​​die BEETLES2-Membran nicht ungehindert passieren können. Interessanterweise beobachteten wir die Permselektivität der BEETLES2-Membran mit den N-Proteinen (~46 kDa) und den Proteinen Rinderserumalbumin (BSA) (~66,5 kDa). Das N-Protein war unter physiologischen Bedingungen positiv geladen, während BSA negativ geladen war. Daher haben wir nur die N-Proteine ​​angereichert, während das negativ geladene BSA frei durch die BEETLES2-Membran passierte und herausgefiltert wurde.

Abbildung 2 zeigt die physikalische und chemische Charakterisierung der BEETLES2-Membran. Es besteht aus RBCM und AAO, den wichtigsten Hybridmaterialien für die Anreicherung. Als Substrat wurde eine wabenartige nanostrukturierte AAO-Membran mit einer ausgerichteten Pore von 20 nm verwendet (Abb. 2a). Die AAO-Membran selbst weist keine Permselektivität auf und ist für die größenbasierte Trennung verantwortlich. Um eine einstellbare Permselektivität hinzuzufügen, haben wir RBCM auf der AAO-Membran funktionalisiert (Abb. 2b). Da das RBCM als physikalische Barriere fungiert, beobachten wir ohne Druck keine einstellbare Permselektivität in der BEETLES2-Membran. Wir beobachteten jedoch eine einstellbare Permselektivität bei einem angelegten Druck von >0,5 bar.

eine AAO-Membran mit einer ausgerichteten Pore von 20 nm als Substrat, die keine Permselektivität zeigt. b Funktionalisierung von RBCM auf der AAO-Membran, die Permselektivität und Abstimmbarkeit unter angelegtem Druck zeigt. c Herstellung und topologische Analyse der BEETLES2-Membran. d AFM-Bilder, die Topographie und Querschnittsprofile aus den Höhenkartenbildern der bloßen AAO- und BEETLES2-Membran zeigen. (e, f) KPFM-Analyse von (e) Oberflächenpotentialbildern der bloßen AAO- und BEETLES2-Membran und f Frequenzen des Oberflächenpotentials in Abhängigkeit von der RBCM-Konzentration (0–4 % (v/v)). Die Daten stammen aus drei gepoolten Experimenten (0 % RBCM, n = 30; 0,1–4 % RBCM, n = 50). g FRAP-Untersuchung der Fluoreszenzintensität mit der Zeit und Bildern, die zeigen, dass RBCM auf dem Substrat seine laterale Diffusionsfähigkeit und Fluidität bei der planaren 2D-Abscheidung gut bewahrt hat und die Wiederherstellung von ~80 % des ursprünglichen Werts in 150 s erfolgte (Spotradius: 20 μm) . Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar. Cartoons in den Panels a–c wurden mit BioRender.com erstellt. BEETLES2, biotechnologisch hergestellte Anreicherungswerkzeuge für die LFA mit erhöhter Empfindlichkeit und Spezifität; AAO nanoporöses anodisches Aluminiumoxid, LFA-Lateral-Flow-Assay, RBCM-Membran roter Blutkörperchen, AFM-Rasterkraftmikroskopie, FRAP-Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung, KPFM-Kelvin-Sondenkraftmikroskopie.

Wir haben die AAO-Membran mit RBCM über die Vesikelfusionsmethode funktionalisiert (Abb. 2c, Abb. S2 und 3). Die Konformationseigenschaften der BEETLES2-Membran wurden mithilfe von Rasterelektronenmikroskopie (REM), Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert. Die unbeschichtete AAO-Membran zeigte ein maschenartiges Netzwerk, das das Eindringen von Wasser und Proteinen unterstützte. Im Gegensatz dazu hatte die BEETLES2-Membran eine glatte Oberfläche, was darauf hindeutet, dass die RBCM-Suspension die poröse Struktur vollständig bedeckte und eine mehrschichtige RBCM-Struktur bildete (~1 μm auf der AAO-Membran, Seitenansicht).

Auf den REM-Bildern (Abb. S4) konnten wir eine konforme Beschichtung von RBCM mit dem geringsten Defekt über 2 % RBCM-Konzentration beobachten. 4 % RBCM zeigten ebenfalls eine konforme Beschichtung; Allerdings verlangsamte es den Wassertransport im Vergleich zu 2 % RBCM. Für eine zusätzliche topologische Analyse haben wir die Oberflächenrauheit der BEETLES2-Membran in Abhängigkeit von der RBCM-Konzentration (0–4 % (v/v)) mittels AFM gemessen (Abb. 2d, S5 und 6). Im gescannten Bereich von 10 × 10 μm bedeutet die Oberflächenwurzel, dass die quadratische Rauheit (Rq) jeder BEETLES2-Membran im Vergleich zu der einer bloßen AAO-Membran deutlich abgenommen hat, was auf eine konformere RBCM-Beschichtung auf der Oberfläche der AAO-Membran hinweist.

Zusammen mit der AFM- und SEM-Analyse führten wir eine Kelvin-Sondenkraftmikroskopie (KPFM) durch (Abb. 2e, f und S7). Über KPFM haben wir die physikalisch-chemischen Charakterisierungen der BEETLES2-Membran gemessen, die aufgrund der negativ geladenen Phospholipide in RBCM29,30 negativ geladen war. Im Gegensatz dazu zeigte die BEETLES2-Membran mit 4 % RBCM eine relativ positiv geladene Oberfläche im Vergleich zu der mit 2 % RBCM. Es wird vermutet, dass sich der Stromfluss zwischen der Spitze des KPFM-Auslegers und der Probe verlangsamt hat, weil das nichtleitende RBCM übermäßig in einem getrockneten Zustand auf der Oberfläche der AAO-Membran gewickelt war31. Als optimale Bedingung haben wir 2 % RBCM gewählt, da ein negativ geladenes Oberflächenpotential der BEETLES2-Membran für die Maximierung der elektrostatischen Wechselwirkung mit dem positiv geladenen Nukleokapsidprotein von Bedeutung ist.

Um die optimale RBCM-Konzentration zu überprüfen, analysierten wir die Fluoreszenzbilder mit unterschiedlichen RBCM-Konzentrationen (0–4 % (v/v)). Fluoreszierende Lipide (PE-CF) wurden in RBCM-Vesikel interkaliert und auf AAO-Membranen aufgetragen. Als nächstes wurden Fluoreszenzbilder gemessen (Abb. S8). Basierend auf topologischer Analyse, KPFM und Fluoreszenzdaten wurde festgestellt, dass eine RBCM-Konzentration von 2 % die beste für die BEETLES2-Membran ist. Darüber hinaus haben wir die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung (FRAP) validiert und die laterale Diffusionsfähigkeit und Mobilität von RBCM auf der AAO-Membran gemessen (Abb. 2g). Die Fluoreszenzwiederherstellung über die photogebleichten Spots (Spotradius: 20 μm) in der Brennebene bestätigte die Bildung mobiler und zusammenhängender Lipiddoppelschichten auf der AAO-Membran. Wir haben den mobilen Anteil (MF) und den 2D-Diffusionskoeffizienten (D) aus der Erholung der Fluoreszenzintensität über die Zeit berechnet. Die gebleichte Fluoreszenz stellte innerhalb von 150 s nach der Laserentfernung allmählich bis zu etwa 80 % des ursprünglichen Wertes wieder her. Wir haben festgestellt, dass der Translationsdiffusionskoeffizient der Zellmembran 0,83 μm2 s−1 betrug, was mit Lipiden in intakten Erythrozyten übereinstimmt (D = 0,82 μm2 s−1)32,33. Dieses Ergebnis zeigt, dass RBCM seine laterale Diffusivität und Fluidität bei der planaren 2D-Abscheidung beibehält.

Abbildung 3 validiert die Leistung der BEETLES2-Membran bei der Erzielung einer schnellen permselektiven Anreicherung mithilfe eines schnellen Wassertransports (Fluss: 221,61 Lm–2 h–1). Darüber hinaus stellen die wassertransportierenden AQP-Proteine ​​auf RBCM einen Schlüsselweg für die permselektive Anreicherung dar (Abb. 3a)34. Wir haben die BEETLES2-Membrananreicherung nach Druck, Molekülgröße, Ladung und Pufferbedingungen klassifiziert. Die AAO-Membran hat eine große Porengröße, die den Durchgang verschiedener Proteine ​​wie Albumin, virales Protein und Immunglobulin ermöglicht. Allerdings kann die BEETLES2-Membran diese Proteine ​​selektiv blockieren, da RBCM als physikalische Barriere fungiert. Interessanterweise können negativ geladene und kleine Moleküle (z. B. Albumin) bei äußerem Druck aufgrund der hohen Mobilität von RBCM leicht in die BEETLES2-Membran eindringen32,35.

ein Flussdiagramm, das die Permselektivität und Einstellbarkeit der BEETLES2-Membran anhand von Druck, Molekülgröße, Ladung und Pufferbedingungen zeigt. b Druckeffekt auf die Anreicherung: negativ geladenes BSA mit starker Abhängigkeit vom Druck, das unter Druck einstellbare Eigenschaften zeigt. c SDS-PAGE von BSA (MW: 66,5 kDa) d Größenbasierte Anreicherung: Immunglobulin G (IgG). e SDS-PAGE von IgG (MW: 150 kDa) und N-Protein (MW: 46 kDa). f Oberflächenladungsbasierte Anreicherung (Permselektivität): Die Anreicherung mit positiv geladenen N-Proteinen. g Oberflächenladungseffekt (Permselektivität): Die Anreicherung mit positiv geladenem BSA (pI: 4,5–4,8) bei niedrigerem pH-Wert, während bei höherem pH-Wert keine Anreicherung erfolgt (neutrale und negativ geladene Bedingungen). (h, j) Erhöhte Empfindlichkeit durch BEETLES2 mit (h) COVID-19-Ag-Test, (i) COVID-19-IgG-Schnelltest und (j) Speichel-COVID-19-Ag-Test. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar. Panel a wurde mit BioRender.com erstellt. VTM-Virustransportmedium, SDS-PAGE-Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, biotechnologisch hergestellte BEETLES2-Anreicherungswerkzeuge für die LFA mit erhöhter Empfindlichkeit und Spezifität.

Um zunächst den Druckeffekt auf die Anreicherung im Hinblick auf die Abstimmbarkeit zu verdeutlichen, haben wir BEETLES2 unter verschiedenen Drücken betrieben (Abb. 3b – f). Der Fehlerbalken in Abb. 3 stellt die Abweichung von Lauf zu Lauf dar (n = 3). Zur Messung der Anreicherung verwendeten wir NanoDrop und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Negativ geladene BSA- und positiv geladene N-Proteine ​​wurden unter physiologischen Bedingungen getestet. Bei positiv geladenen N-Proteinen überstieg die Anreicherung das 24-fache, gemessen mit Nanotropfen, unabhängig vom Druck (0,1–3 bar). Im Gegensatz dazu zeigte negativ geladenes BSA eine starke Abhängigkeit vom Druck (Abb. 3b). Insbesondere bei BSA-Proben mit niedrigerem Druck (0,1 bar) wurde ein deutlicher Anstieg der Anreicherung beobachtet, da kein BSA durchdrang. Die wahrscheinlichste Erklärung ist das Zusammendrücken der Zellen, das die Abgabe einer Vielzahl von Materialien ermöglicht36, was die Notwendigkeit darstellt, Druck für die Permeation negativ geladener Proteine ​​auszuüben. Mit zunehmendem Druck passierte BSA die BEETLES2'-Membran ungehindert, ohne nennenswerte Anreicherung. Wichtig ist, dass wir mit den unter Druck einstellbaren Eigenschaften das am häufigsten vorkommende Protein, d. h. Albumin, und kleine Inhibitoren effizient entfernen konnten. Bei der SDS-PAGE wurde BSA unter 0,1 bar angereichert, während es über 1 bar durchlief, was eindeutig die Einstellbarkeit der Anreicherung unter verschiedenen Drücken bestätigt (Abb. 3c).

Zweitens zeigten wir die Anreicherung von IgG mit einem Molekulargewicht (MW) von 150 kDa, dem häufigsten Antikörper im Blut und anderen Körperflüssigkeiten (Abb. 3d). Die tägliche Überwachung von IgG könnte ein entscheidender Test für die Genesung bei COVID-19 sein. Dank der Größenfiltration konnten wir IgG unabhängig vom angewandten Druck (0,1–3 bar) bis zum 18-fachen anreichern. Um den Größeneffekt von IgG zu validieren, testeten wir menschliche IgG-Fc-Fragmente (MW: 50 kDa) und beobachteten keine Anreicherung von IgG-Fc-Fragmenten bei einem Druck von 3 bar, was auf den Größeneffekt von negativ geladenem IgG auf die Anreicherungen schließen lässt (Abb. S9). ). Der Druck wurde mit reglergesteuertem Stickstoffgas gesteuert. Wir haben 3 ml jeder Probe auf ein Endvolumen von 100 µL angereichert, was theoretisch einer 30-fachen Anreicherung entspricht. Die IgG-Anreicherung wurde unter einem Druck von 3 bar bestätigt (SDS-PAGE in Abb. 3e). Im Gegensatz zu einem Antigen- oder Virus-basierten Test wurden für serologische Schnelldiagnosetests nur 1–2 Tropfen (<100 µL) Blut verwendet. Um Proben im Dutzend-µL-Bereich zu handhaben, ist ein neues Design erforderlich. Ein solches prospektives Design könnte das membranintegrierte Mikrofluidiksystem BEETLES2 sein.

Drittens überprüften wir den Oberflächenladungseffekt auf die Permselektivität und Anreicherung von Biomolekülen (Abb. 3f). Unter physiologischen Bedingungen zeigten N-Proteine ​​(MW: 46 kDa) mit isoelektrischen Punkten (pI) von 10,3–10,7 insgesamt eine positive Ladung, während BSA (MW: 66,5 kDa) einen pI von 4,5–4,8 aufwiesen, was zu einer negativen Ladung führte. Der angelegte Druck betrug 3 bar. Bei einem ähnlichen Molekulargewicht betrug die Anreicherung nur mit N-Proteinen etwa das 24,16-fache, wohingegen BSA keine signifikante Anreicherung zeigte. Im Gegensatz zu den einstellbaren Eigenschaften des negativ geladenen BSA zwischen Anreicherung und Trennung durch Druck zeigten positiv geladene N-Proteine ​​nur eine Anreicherung ohne Einstellbarkeit. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die BEETLES2-Membran das Eindringen positiv geladener Proteine ​​durch die Filter über die elektrostatische Wechselwirkung von negativ geladenen Phospholipiden und positiv geladenen Virusproteinen unter physiologischen Bedingungen vollständig blockiert37. Die angereicherten N-Proteinproben wurden nach 3 Minuten BEETLES2-Betrieb erfasst (SDS-PAGE in Abb. 3e). Im Gegensatz dazu wurde nach 3 Minuten keine Anreicherung durch BSA in der Anreicherungszone beobachtet.

Um den Oberflächenladungseffekt auf die Anreicherung zu überprüfen, der die Permselektivität darstellt, haben wir die Oberflächenladung von BSA kontrolliert (Abb. 3g). Wir haben A280-Absorptionsmessungen mit NanoDrop durchgeführt, um den Anreicherungsfaktor zu definieren. Unter einer pH-Bedingung unterhalb des pI-Werts von BSA (pI: 4,5–4,8) war die Gesamtoberflächenladung positiv. Bei pH 3–4 und unter positiv geladenen Bedingungen wurde BSA bis zum 18,2-fachen angereichert. Interessanterweise nahm der Anreicherungsfaktor in der Nähe des pI-Werts abrupt ab, wo die Gesamtladung neutral schien. Die wahrscheinlichste Erklärung für die Anreicherung ist die elektrostatische Kraft zwischen dem positiv geladenen Protein und der negativ geladenen BEETLES2-Membran. Bei einem höheren pH-Wert war die Gesamtladung von BSA negativ. Somit wurde keine signifikante Abnahme des Anreicherungsfaktors beobachtet.

Abbildung 3h zeigt die erhöhte Empfindlichkeit von COVID-19 Ag unter Verwendung von BEETLES2. Im Vergleich zu einem kommerziellen LFA (AllCheck COVID-19 Ag, Calth Inc., Republik Korea) ohne BEETLES2-Anreicherung nahmen alle kolorimetrischen Signale über BEETLES2 zu, was auf eine höhere Nachweisempfindlichkeit hinweist. Wir stellten durch Verdünnen von N-Proteinen mit einem PBS-Puffer sieben verschiedene Konzentrationen her und testeten für jeden Punkt drei Proben. Die LOD wurde nach der BEETLES2-Anreicherung um das bis zu 20-fache erhöht.

Um die Vielseitigkeit des COVID-19-Tests zu validieren, führten wir den COVID-19-IgG-Schnelltest durch (Abb. 3i). Ähnlich wie beim COVID-19-Ag-Test konnten wir durch den Probenanreicherungsprozess eine erhöhte Empfindlichkeit beobachten. Der Test wurde dreimal pro Punkt für sieben verschiedene Konzentrationen durchgeführt. Folglich wurde die LOD nach der BEETLES2-Anreicherung um das bis zu 20-fache erhöht, was eine große Anwendbarkeit im LFA-Assay zeigt. Wir haben bestätigt, dass BEETLES2 N-Proteine ​​und IgG anreichern kann, die die Hauptziele für den SARS-CoV-2-Test sind. Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, dass BEETLES2 auf andere Zielviren wie Influenza A/B angewendet werden könnte, da ihre N-Proteine ​​und IgG-Eigenschaften denen von SARS-CoV-2 ähneln. Um die Anwendbarkeit von BEETLES2 auf andere Viren zu validieren, führten wir einen Influenza-Schnelltest durch (Abb. S10). Wir verwendeten Influenza-Antigen A (Shangdong/9/93 (94/516, NIBSC, Vereinigtes Königreich) und B (Wisconsin/1/2010 (aus Zellen gewonnen) (12/110, NIBSC, Vereinigtes Königreich) mit ihren Schnellkits (SGT i -flex Influenza A&B, Sugentech, Republik Korea). Ähnlich wie beim COVID-19 Ag-Test haben wir mithilfe des Probenanreicherungsprozesses ein verbessertes kolorimetrisches Signal erhalten.

Um die Machbarkeit eines Speicheltests zu demonstrieren, führten wir den COVID-19 Ag-Test mit Speichelproben durch (Abb. 3j). Die N-Proteine ​​wurden in sieben verschiedenen Konzentrationen in künstlichem Speichel versetzt. Da kommerzielles LFA nicht für Speicheltests optimiert war, zeigten die kolorimetrischen Daten mit kommerziellem COVID-19 Ag LFA eine geringere Erkennungsleistung bei höherem LOD. Mit BEETLES2 haben wir die Sensorleistung mit zunehmender LOD um das bis zu 20-fache gesteigert.

Klinische Proben (COVID-19-Patienten (n = 42) und gesunde Kontrollpersonen (n = 20)), einschließlich NP/OP-Abstriche (n = 30) und Speichelproben (n = 12), wurden verwendet, um das klinische Potenzial von BEETLES2 zu validieren (Abb . 4). Um die Leistungssteigerung deutlich zu demonstrieren, haben wir Proben mit mittlerer (26 ≤ Ct <30, n = 15: 15/42, 35 %) und niedriger Viruslast (Ct ≥ 30, n = 20: 20/42, 48 %) eingeschlossen Die Empfindlichkeit kommerzieller LFA sank abrupt.

Zu den klinischen Proben gehören COVID-19-Patienten (n = 42) und gesunde Kontrollpersonen (n = 20). Wir haben Patientenproben mit niedriger Viruslast (Ct ≥ 30, n = 20: 48 %) eingeschlossen, um die Verstärkung bei niedriger Viruslast zu beobachten. Wir haben den klinischen Test für jeden Patienten einmal durchgeführt (n = 1). a–f Empfindlichkeitssteigerung mit BEETLES2 unter Verwendung von (a) NP/OP-Proben, (b) Speichelproben, (c) Delta-Varianten, d Omicron-Varianten, (e) Proben von asymptomatischen Personen und (f) gesunden Kontrollpersonen. g–i Die diagnostische Genauigkeit von BEETLES2, einschließlich aller Proben von NP/OP, Speichel, asymptomatischen und verschiedenen Varianten, zeigt, dass die Gesamtempfindlichkeit von BEETLES2 deutlich höher ist (88,1 %) (P < 0,0001) als die von denen, die kommerzielles LFA verwenden ( 14,29 %) (P = 0,0041). Für die Analyse wurde der zweiseitige ungepaarte t-Test verwendet und für Mehrfachvergleiche wurden keine Anpassungen vorgenommen. j Kreuzreaktivität mit verschiedenen Atemwegsviren, die keine Kreuzreaktivität zeigt. k RT-qPCR mit Anreicherung nur mit AAO und BEETLES2, was zeigt, dass BEETLES2 die molekulare Diagnostik auch mit VTM verbessern kann. l–n Die Machbarkeit einer täglichen Überwachung von COVID-19 stellt die Möglichkeit häufiger Tests mit deutlich höherer Genauigkeit dar. Mit BEETLES2 haben wir den Ct-Wert über 37 gemessen. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar. VTM-Virustransportmedium, biotechnologisch hergestellte BEETLES2-Anreicherungswerkzeuge für die LFA mit erhöhter Empfindlichkeit und Spezifität, anodisches AAO-Aluminiumoxid, LFA-Lateral-Flow-Assay, NP/OP nasopharyngeal/oropharyngeal.

Berichten zufolge muss die Testgenauigkeit aufgrund der Heterogenität von Antigentests und Bevölkerungsgruppen für verschiedene Gruppen und Proben ermittelt werden8. Wir haben die am weitesten verbreiteten SARS-CoV-2-, Delta- und Omicron-Varianten analysiert. Berichten zufolge betrug der gepoolte Prozentsatz der asymptomatischen Infektionen für Omicron 32,40 %38. Wir haben auch die Fähigkeit überprüft, asymptomatische Personen zu testen. Die meisten Proben wurden im Seoul St. Mary's Hospital gesammelt. Wir haben klinische NP/OP in einem Virustransportmedium (VTM) gesammelt und einen Assay unter Verwendung des Standardprotokolls gemäß den Richtlinien des LFA-Herstellers vorbereitet. Wir haben den kommerziellen LFA zur Kontrolle als „ohne BEETLES2“ bezeichnet und den durch BEETLES2 unterstützten kommerziellen LFA als „mit BEETLES2“ bezeichnet. Wir haben den Grenzwert ermittelt, indem wir die Summe aus Sensitivität (echt positiv) und Spezifität (echt negativ) von COVID-19-Tests maximiert haben.

Zuerst haben wir die Empfindlichkeitssteigerung mit BEETLES2 anhand von NP/OP-Proben überprüft (Abb. 4a: n = 30). Nach dem Laden wurden Proben von NP/OP mit einem PBS-Puffer verdünnt und in die Rührzelle injiziert. Anschließend wurde mit einem Regler ein konstanter Druck (~3 bar) angelegt. Im Allgemeinen führte die Empfindlichkeit kommerzieller LFA zu einem abrupten Rückgang der Virustiter bei mittlerer und niedriger Viruslast (Ct ≥ 26). Bei NP/OP-Proben betrug die Sensitivität kommerzieller LFA 10 % (3/30 = 10 %). Die Sensitivität wurde dann mit BEETLES2 erhöht (27/30 = 90 %).

Zweitens haben wir die Empfindlichkeit anhand von Speichelproben validiert (Abb. 4b). Ein Assay mit Speichelproben bietet erhebliche Vorteile für die einfache und nicht-invasive Probenentnahme39; Speicheltests erfordern jedoch zusätzliche Probenentnahmeschritte wie Vorfiltration. Für die Vorfiltration von Zellen und Zelltrümmern verwendeten wir eine 450-nm-Filtermembran. Berichten zufolge weisen Tests mit Speichelproben in den ersten 10 Tagen nach der Infektion eine höhere Nachweisempfindlichkeit auf40. Im Vergleich zur Empfindlichkeit des kommerziellen LFA vor der Anreicherung (3/12 = 25 %) wiesen alle mit BEETLES2 getesteten Proben eine höhere Empfindlichkeit auf (10/12 = 83,3 %), was auf eine Leistungssteigerung nach der Probenanreicherung hinweist. Für den praktischen Einsatz von Speicheltests mit BEETLES2 empfehlen wir ein einfaches Speichelsammel- und -reinigungssystem (Pure-SAL, Oasis Diagnostics) (Abb. S11a).

Drittens haben wir die Empfindlichkeit anhand von zwei Varianten beobachtet (Abb. 4c bzw. d). Im Allgemeinen zielt der LFA des COVID-19-Ag-Tests auf N-Proteine ​​ab. Im Gegensatz zu RT-qPCR, das stark von der Variante abhängt, wie etwa Delta und Omicron41, sind die N-Proteine, auf die der COVID-19-Ag-Test abzielt, weniger von Mutationen abhängig. Sowohl für Delta (n = 10, Abb. 4c) als auch für Omicron (n = 32, Abb. 4d) wurden alle Proben mit BEETLES2 und kommerziellem LFA getestet. Folglich erreichten wir mit BEETLES2 eine höhere Empfindlichkeit für Delta (10/10 = 100 %) und Omicron (27/32 = 84,38 %) als mit kommerziellem LFA: 20 % (2/10 = 20 %) und 12,5 % (4/32). = 12,5%) für Delta bzw. Omicron.

Viertens betrachteten wir asymptomatische Fälle (Abb. 4e). Die schnelle Identifizierung asymptomatischer Fälle ist eine Schlüsselstrategie zur Reduzierung der Weiterübertragung von COVID-19-Viren42. Die wirklich positiven Werte, dh die Empfindlichkeit, waren bei der Verwendung von BEETLES2 höher (3/4 = 75 %) als bei der kommerziellen LFA (Kontrollen: 0/4 = 0 %). Wir haben Datenpunkte in der Nähe der Grenzlinie mit LFA-Testergebnissen erläutert (Abb. S12). Obwohl die Anzahl der asymptomatischen Proben nicht ausreichte, könnte BEETLES2 eine frühere und bessere Erkennung asymptomatischer Personen ermöglichen.

Fünftens haben wir zur Überprüfung der Spezifität die kolorimetrischen Signale von gesunden Kontrollpersonen (n = 20) getestet, die eine Spezifität von 100 % zeigten (echte Negative = 20/20) (Abb. 4f). Spezifität wird als wahre Negativrate bezeichnet. Daher haben wir die Spezifität erhöht, indem wir falsch positive Ergebnisse reduziert haben.

Insgesamt beurteilten wir die diagnostische Genauigkeit von BEETLES2 unter Berücksichtigung aller NP/OP-, Speichel-, asymptomatischen und verschiedener Varianten (Abb. 4g und h). Abbildung 4g zeigt den Assay mit BEETLES2 und Abb. 4h zeigt den Assay mit kommerziellem LFA. Die insgesamt echten positiven Werte, d. h. die Empfindlichkeit, sind bei der Verwendung von BEETLES2 deutlich höher (37/42 = 88,1 %) als bei denen, die kommerzielles LFA ohne BEETLES2 verwenden (6/42 = 14,29 %) (Abb. 4i). Unser vorgeschlagenes BEETLES2-System erfüllt die „wünschenswerten Kriterien“ der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für POCT (Sensitivität: >90 %, Spezifität: >99 %, Ct ≥ 30 und Testzeit: <20 Minuten) über die „akzeptablen Kriterien“ hinaus. (Sensitivität: >80 %, Spezifität: >97 %, 26 ≤ Ct ≤35 und Testzeit: <40 Min.)43.

Ein weiterer wichtiger Parameter für die COVID-19-Diagnostik ist die Kreuzreaktivität (Abb. 4j). Wir haben die Kreuzreaktivität mit verschiedenen Atemwegsviren wie dem Respiratory Syncytial Virus A (RSV A), RSV B, Influenza A (H1N1), Influenza B und dem humanen Coronavirus-OC43 (HCoV-OC43) bewertet (n = 3 für jede Probe). und es wurde keine Kreuzreaktivität beobachtet.

Sowohl der LFA-Test als auch die BEETLES2-Anreicherung könnten zur Kreuzreaktivität und Spezifität beitragen. Da der LFA-Hersteller jedoch die Kreuzreaktivität und Spezifität (>99 %) streng kontrolliert, gehen wir davon aus, dass die Ergebnisse der Kreuzreaktivität und Spezifität hauptsächlich auf die BEETLES2-Anreicherung zurückzuführen sind (Tabelle S1). Wir haben keine Kreuzreaktivitäts- und Spezifitätsprobleme bei anderen Viren festgestellt, was ein hohes Potenzial zur Erfüllung der WHO-Kriterien zeigt.

Eine AAO-Membran wurde verwendet, um einen Immunoassay für den SARS-CoV-2-Nachweis im Speichel durch Anreicherung von SARS-CoV-2-Viren zu entwickeln9. Im Anschluss an diese Studie haben wir nur eine AAO-Membran hergestellt und die Virusreinigung und -anreicherung mittels RT-qPCR beobachtet (Abb. 4k). In PBS-Puffer könnten die intakten Viren wie dargestellt durch die AAO-Membran angereichert werden. Allerdings konnten wir Viruspartikel nicht mit der AAO-Membran in einem Lysatpuffer (VTM) anreichern, da es an VTM lysierte Viren zur Anreicherung mangelte. Daher änderte sich der Ct-Wert bei Verwendung der AAO-Membran nicht wesentlich. In vielen realen klinischen Fällen werden Proben mit inaktiviertem Lysat (dh VTM) geliefert. Der Ct-Wert wurde mit BEETLES2 sogar mit VTM auf bis zu 5,1 verbessert, was theoretisch 34,3 Anreicherungskonzentrationen entspricht.

Um die Möglichkeit einer täglichen Überwachung von COVID-19 zu gewährleisten, haben wir täglich NP/OP- und Speichelproben von infizierten Personen mit Symptomen gesammelt (Abb. 4l–m). Der Tag des Auftretens (Tag 0) wurde als erster Tag der Symptome definiert. Alle Patienten waren am ersten Tag der Symptome RT-qPCR-positiv. Wir haben tägliche Daten über RT-qPCR und LFA mit BEETLES2-Anreicherung erfasst. Da RT-qPCR die Virusausscheidung lange nach der Infektionsperiode (ca. 9 Tage) erkennen kann, kann das positive Ergebnis von RT-qPCR eine unnötige Quarantäne beinhalten. Umgekehrt können häufige hochempfindliche LFA-Tests (2–3 tägliche Tests) zu Veränderungen des Ein-/Aus-Signals und sogar der quantitativen Daten führen. Tägliche Überwachungsdaten zeigten, dass der LFA-Assay mit BEETLES2 stark mit der Viruslast (Ct-Wert) korreliert, was bedeutet, dass unsere Technik häufige Tests mit deutlich höherer Genauigkeit auswertet als der kommerzielle LFA und RT-qPCR. Mit BEETLES2 konnten wir einen Ct-Wert über 37 messen, der mit dem kommerziellen LFA nicht erkannt werden konnte (Abb. 4n).

Im Vergleich zu anderen vorhandenen Techniken zur Virusisolierung und -anreicherung bietet unser BEETLES2 Vorteile in Bezug auf Permselektivität, Abstimmbarkeit, leistungsstarke Anreicherungsfähigkeit sowohl für intakte Viren als auch für ihre N-Proteine ​​sowie die Anwendbarkeit als Handgerät (siehe Tabelle S2 für den Vergleich verschiedener). Techniken zur Virusisolierung und Anreicherungsfokussierung). Um BEETLES2 zu kommerzialisieren, sollten wir uns mit den folgenden Problemen befassen: 1) druckbeständiges Design. Da der BEETLES2-Assay unter Druck durchgeführt wird, kann kein Austreten von Flüssigkeitsproben toleriert werden. Insbesondere beim Umgang mit infektiösen Proben ist aus Sicherheitsgründen eine leckagefreie Konstruktion erforderlich. 2) Die Volumenproblematik bei serologischen Schnelltests. Für serologische Schnelldiagnosetests werden 1–2 Tropfen (<100 µL) typischerweise aus einem Fingerstich gewonnen; Daher müssen wir Geräte für blutbasierte Tests mit kleinen Probenvolumina entwickeln. Ein in die BEETLES2-Membran integriertes Mikrofluidikgerät ist ein idealer Kandidat für serologische Tests. 3) Die Haltbarkeit ist ein Schlüsselparameter für die Kommerzialisierung von BEETLES2. Bei Raumtemperatur erreichten wir eine Stabilität von bis zu 15 Tagen. Allerdings lässt sich die erwartete Haltbarkeit durch zusätzliche Tests noch weiter verlängern (Abb. S13).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Probenvorbereitung von BEETLES2 mit ihrer leistungsstarken Permselektivität und Abstimmbarkeit eine empfindlichere binäre Reaktion als kommerzielles LFA in 3 Minuten liefert. Es hat zwei wesentliche praktische Vorteile: Erstens kann das System problemlos mit etablierten kommerziellen LFAs gekoppelt werden und erhöht im Vergleich seine klinische Empfindlichkeit (>88 %) und Genauigkeit (>91 %) für klinische Proben mit niedrigem Titer, einschließlich Delta- und Omicron-Varianten mit kommerzieller LFA (14,29 % bzw. 41,94 %). Zweitens kann BEETLES2 das SARS-CoV-2-Virus, N-Proteine ​​und IgG aus Nasenabstrich, Speichel und Blutserum selektiv anreichern, was seine Vielseitigkeit und Anwendbarkeit für COVID-19-Ag- und IgG-Tests unter Beweis stellt.

Die Kombination der Probenanreicherung von BEETLES2 mit kommerziellem LFA stellt einen Fortschritt in der POCT-Detektion dar, da sie alle von der WHO für POCT genannten Anforderungen erfüllt, d. h. Benutzerfreundlichkeit, niedrige Kosten und Genauigkeit44. Wir gehen davon aus, dass BEETLES2 mit nominalen Mehrkosten kommerzialisiert wird und damit die Kriterien der Kostengünstigkeit erfüllt. Darüber hinaus könnte die Kombination von KI-gestützten Smartphone-Anwendungen mit BEETLES2 das Ein-/Ausschalten präzise vorhersagen und eine quantitative Klassifizierung durchführen, was ein großes Potenzial für REASSURED zeigt (Echtzeitkonnektivität, einfache Probenentnahme, erschwinglich, empfindlich, spezifisch, benutzerfreundlich, Schnell, ausrüstungsfrei und geliefert)45, ein neues Kriterium für digitale Konnektivität, und möglicherweise eine asymptomatische Übertragung mit einfachen häufigen Teststrategien erkennen8,42, was bei RT-qPCR-Tests schwierig ist.

Von April 2021 bis Mai 2022 wurden im Seoul St. Mary's Hospital prospektiv Atemwegsproben von Patienten entnommen, bei denen eine COVID-19-Infektion diagnostiziert wurde. Diese Studie wurde vom Institutional Review Board (KC21TIDI0134K) des Seoul St. Mary's Hospital genehmigt und eine Einverständniserklärung eingeholt von den Teilnehmern.

Wir extrahierten RBCM aus mit K2EDTA antikoaguliertem menschlichem Vollblut und entfernten das Plasma und den Buffy Coat mit einer 800-g-Zentrifuge für 5 Minuten, um rote Blutkörperchen zu isolieren. Nachdem wir den Überstand entfernt hatten, wuschen wir die verbleibenden roten Blutkörperchen dreimal mit eiskaltem 1×PBS unter leichtem Händeschütteln. Als nächstes hämolysierten wir die roten Blutkörperchen, indem wir sie 30 Minuten lang in eiskaltem 0,25 × PBS suspendierten. Schließlich haben wir freies Hämoglobin 30 Minuten lang mit einer 20.000-g-Zentrifuge eliminiert. Nach dreimaligem Auswaschen wurde ein hellrosa RBCM-Pellet erhalten und zur späteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Die extrahierten RBCMs lagen in Form eines negativ geladenen Liposoms mit einer Größe von 200 nm vor (Abb. S2). Die beschallte Lösung wurde auf die AAO-Membran (6809-6002, Whatman, UK) getropft und 30 Minuten lang bei 50 °C inkubiert, um mehrere unterstützte Lipiddoppelschichten zu bilden. Um die Mikrostruktur der BEETLES2-Membran zu untersuchen, führten wir eine Strukturanalyse mittels SEM, AFM und Fluoreszenzmikroskopie durch.

AAO-RBCM-Membranen wurden für die KPFM-Bildgebung auf einem Siliziumwafer vom p-Typ (ePAK International, USA), einem Substrat mit elektrischer Leitfähigkeit, beprobt. Die Siliziumwafer wurden 15 Minuten lang in Piranha-Lösung (H2O2 und H2SO4) getaucht, mit destilliertem Wasser gewaschen und mit N2-Gas (Sejong Industrial Gas Co., Korea) getrocknet. Ein MultiMode VIII-Rasterkraftmikroskop wurde verwendet, um die AAO-RBCM-Membranen elektrisch und topologisch im amplitudenmodulierten KPFM-Modus (Bruker, USA) zu analysieren. KPFM-Messungen wurden bei 23 °C in Luft im Lift-Scan-Modus basierend auf dem Tapping-Modus durchgeführt. Zur Analyse der nanoelektrischen Eigenschaften der Proben wurden mit Pt beschichtete leitfähige AFM-Spitzen (SCM-PIT-V2; Bruker, USA) verwendet. Im ersten Scan wurde ein topologisches AFM-Bild im Tapping-Modus mit Zero-Tip-Bias aufgenommen. Um die Oberflächenpotentiale zu erfassen, wurde die AFM-Spitze während des Interleave-Scannens mit angelegter Probenvorspannung 20 nm über die Probenoberfläche angehoben. Der mechanische Antrieb des Auslegers wurde während des Interleave-Scannens ausgeschaltet und eine Vorspannung aus Wechselstrom (AC) von 1000 mV wurde an die Sonde bei der mechanischen Resonanz (ω) des Auslegers angelegt. Die VAC bringt den Cantilever aufgrund anziehender und abstoßender elektrostatischer Wechselwirkungen (Fes) zwischen Sonde und Probe zum Schwingen, die wie folgt definiert sind:

Dabei ist VDC die Gleichstrom-Vorspannung (DC) und VCPD die Kontaktpotentialdifferenz zwischen Sonde und Probe.

Durch Anlegen einer kompensierenden Gleichspannung an die Sonde zur Eliminierung elektrostatischer Kräfte (d. h. Fes) zwischen Sonde und Probe wird eine Proportional-Integral-Derivativ-Rückkopplungsschleife aufgebaut, die die Amplitude der Auslegerschwingungen überwacht und steuert. Diese hängen von der Kapazität C und der Höhe z der Sonde und Probe ab. Die KPFM-Scanrate betrug 0,6 Hz, die Scangröße und der Amplitudensollwert bei 12 nm betrugen 4 μm × 4 μm bei 512 × 512 Pixeln. Die MountainsSPIP-Software wurde zum Nivellieren, Verarbeiten und Analysieren der AFM-Bilder verwendet (Version 9; Digital Surf, Frankreich). Darüber hinaus wurden mit Gwyddion Oberflächenrauheitsstudien durchgeführt (Version 2.60).

FRAP wurde verwendet, um die SLB-Bildung von RBCMs zu validieren und deren Fluidität und Diffusionsfähigkeit zu bewerten. In allen Experimenten wurde 1 Gew.-% PE-CF als Fluoreszenzsonde in RBCMs interkaliert. Wir haben einen Fleck mit 20 μm Durchmesser in der Z-Ebene der RBCM-Schichten mit einem optisch gepumpten 488-nm-Halbleiterlaser (Coherent, Inc.) bei 150 mW 5 s lang gebleicht. Die Wiederherstellung der Fluoreszenz nach dem Photobleichen an der gewünschten Stelle wurde 5 Minuten lang mit einem konfokalen Zeiss LSM-800-Mikroskop überwacht. Jeder Bildreferenzpunkt diente als Standard zur Messung und Normalisierung der Spot-Fluoreszenzintensität. Die normalisierte Fluoreszenzintensität gegen die Zeit, angepasst an eine Bessel-Funktion, wurde von Soumpasis et al.26 berichtet. Als nächstes wurde der Diffusionskoeffizient (D) des Farbstoffs in jeder SLB-Zusammensetzung unter Verwendung des folgenden Ausdrucks berechnet: D = w2/4t1/2, wobei w der Radius des photogebleichten Flecks und t1/2 die Zeit ist, die erforderlich ist, um die Hälfte zu erreichen der maximalen Wiederherstellung der Fluoreszenzintensität.

Wir haben kommerzielle COVID-19 Ag-Schnellkits (Calth Inc., Republik Korea) verwendet und die verbesserte Leistung über BEETLES2 getestet. Wir haben ein rekombinantes COVID-19-N-Protein-Antigen (45 kDa, FPZ0516, Fapon Biotech Inc., China) hergestellt, das als das beste COVID-19-Ag-Testziel gilt, und zum Testen 1×PBS-Puffer (LB004, DUKSAN, Republik Korea) verwendet Empfindlichkeit und LOD. Rinderserumalbumin (BSA) (A7030, Sigma-Aldrich, USA), menschliches IgG (I4506, Sigma-Aldrich, USA) und menschliche IgG-Fc-Fragmente (401104, Sigma-Aldrich, USA) wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Anschließend bereiteten wir sieben Konzentrationen der COVID-19 N-Proteinprobe mit 1xPBS vor. Wir gaben ca. 3 ml jeder Probe in eine Rührzelle aus Polycarbonat (341000, STERLITECH, USA) und ließen sie 3 Minuten lang laufen. Anschließend wurden 100 μl der angereicherten Probe mit einer Pipette entnommen. Zur Analyse und Quantifizierung von Proteinen wurden NanoDrop-Spektrophotometer (Thermo Scientific, USA) und SDS-PAGE (KOMA-Fertiggel BC-Typ, Koma Biotech, Republik Korea) verwendet.

Für den COVID-19-Ab-Test (Abb. 3i) haben wir sieben Konzentrationen der Probe des COVID-19-Antikörpers (Natriumcitratplasma, Trina Bioreactives AG, Schweiz) mit 1xPBS vorbereitet. Wir gaben 3 ml jeder Probe in eine gerührte Polycarbonatzelle (341000, STERLITECH, USA), die mit einer RBCM-beschichteten AAO-Membran ausgestattet war, und ließen sie 3 Minuten lang laufen. Anschließend wurde die angereicherte Probe über eine Pipette mit 100 μl LFA-Extraktionspuffer gewonnen. Anschließend verwendeten wir die angereicherte Probe im COVID-19 Ab LFA-Kit (AllCheck COVID-19 IgG/IgM, Calth Inc., Korea) und notierten das Ergebnis nach 10 Minuten.

In ähnlicher Weise haben wir für den Speichel-COVID-19-Ag-Test (Abb. 3j) sieben Konzentrationen der COVID-19-N-Proteinprobe mit künstlichem Speichel (A7990, Solarbio, China) verdünnt. Zuerst gaben wir 3 ml jeder Probe in eine gerührte Polycarbonatzelle, die mit einer RBCM-beschichteten AAO-Membran ausgestattet war, und ließen sie 3 Minuten lang laufen. Anschließend wurde die angereicherte Probe über eine Pipette mit 100 μl LFA-Extraktionspuffer gewonnen. Anschließend verwendeten wir die angereicherte Probe im COVID-19 Ag LFA-Kit und notierten das Ergebnis nach 10 Minuten.

Wir haben die Farbintensitäten des kommerziellen LFA-Kits und des BEETLES2-unterstützten LFA mithilfe eines maßgeschneiderten, von National Instrument (NI) gesteuerten optischen Systems in Verbindung mit LabVIEW v 2019 SP1 (National Instruments Co., USA) analysiert. Um die LOD- (Abb. 3) und Cut-off-Werte (Abb. 4) festzulegen, haben wir zunächst Farbsignale mit dem kommerziell erhältlichen Lesegerät und einem maßgeschneiderten NI-gesteuerten optischen System mit LabVIEW gemessen. Als nächstes beobachteten fünf individuell geschulte Ingenieure (Calth Inc. http://www.thecalth.com) das kolorimetrische Signal anhand der Standardfarbkarte und der Herstellerrichtlinien, um den LOD zu bestimmen. In der Zwischenzeit legen wir die Grenzwerte fest, um Fehlalarme zu minimieren und so eine höhere Spezifität gemäß den Richtlinien des Herstellers zu erreichen.

Wir haben mit der entsprechenden Genehmigung des Institutional Review Board Committee (KC21TIDI0134K) klinische NP/OP- und Speichelproben von COVID-19-Patienten im Seoul St. Mary's Hospital gesammelt. Obwohl NP/OP-Tupfer im Virustransportmedium (VTM) enthalten waren, wurden Speichelproben in einem sterilisierten Röhrchen gesammelt und mit PBS verdünnt.

Um die Leistung bei Zielen mit geringer Viruslast und hoher Viruslast (Ct <26) zu testen, haben wir NP/OP-Proben in PBS-Puffer gegeben und sie als Proben mit geringer Viruslast vorbereitet. Bei Speichelproben mit hoher Viruslast haben wir die Proben mit PBS-Puffer versetzt. Schließlich bereiteten wir Proben mit niedrigem Virusgehalt und einem Ct ≥ 30 vor. Für gesunde Kontrollpersonen sammelten (oder kauften) wir Proben von gesunden Freiwilligen und lagerten sie bei –20 °C. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mit RT-qPCR-SARS-CoV-2-Tests unter Verwendung des AccuPower® SARS-CoV-2-Varianten-ID2-Kits (BIONEER, Republik Korea) gemäß dem Protokoll des Herstellers verglichen. Der Grenzwert für die Vor-Ort-Diagnostik von COVID-19 wurde durch Maximierung der Summe aus Sensitivität (echt positiv) und Spezifität (echt negativ) von COVID-19-Tests ermittelt.

Um den Prototyp für die POCT-Probenvorbereitung zu realisieren, haben wir ein handbetriebenes tragbares Gerät hergestellt, das in die BEETLES2-Membran integriert ist (siehe Abb. S11). Wir haben zwei Reservoirs entworfen: Proben- und kommerziell erhältliche Laufpufferreservoirs. Für den Prototyp wurde Mikrofräsen eingesetzt. Wir haben den durchschnittlichen handbetriebenen Druck von fünf Personen (vier Männer und eine Frau) mit BEETLES2 auf 2,3 ± 0,2 bar berechnet (Abb. S14). Wir haben gezeigt, dass die Permselektivität von BSA- und N-Proteinen unter handbetriebenem Druck aufrechterhalten wird. Handbetriebene tragbare Spritzen sind kostengünstige Alternativen für die Point-of-Care-Diagnostik, die direkt auf die kommerzielle LFA anwendbar sind. Wir haben zunächst die BEETLES2-Membran mit dem Probenreservoir verbunden und den Kolben zur Anreicherung gedrückt. Nach 3 Minuten Betrieb kehrten wir die Richtung der Befestigung der BEETLES2-Membran am laufenden Pufferreservoir um. Da der kommerzielle Laufpuffer ein Tensid enthielt, konnten wir den N-Protein-Assay unabhängig von der elektrostatischen Kraft zwischen dem N-Protein und der RBCM-Schicht erfolgreich demonstrieren. Anschließend führten wir einen Test mit kommerziellem LFA gemäß den Richtlinien des Herstellers durch. Mit weiteren Untersuchungen entwickeln wir einen vereinfachten zweiten Prototyp, bei dem eine Vakuumkammer zum Ausüben von Druck verwendet wird.

Die in den Abbildungen dargestellten Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar. Wir haben alle Experimente mindestens dreimal pro Punkt wiederholt und die Daten mit Microsoft Exel, Prism v 7.0, analysiert. Für grafische Analysen wurden die Software Biorender, 3D MAX v 2020, V-Ray v 4.0, Adobe Photoshop v 2020 und Adobe Illustrator v 2020 verwendet. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Um die Bedeutung der klinischen Validierung zu bestimmen, haben wir ihre Daten mit einem zweiseitigen ungepaarten T-Test analysiert, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu untersuchen. Ein AP-Wert unter 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

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Diese Forschung wurde durch das Bio & Medical Technology Development Program der National Research Foundation (NRF) unterstützt, das von der koreanischen Regierung (MSIT) finanziert wird (Nr. 2021M3E5E3080743).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Seong Jun Park, Seungmin Lee, Dongtak Lee.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Dae Sung Yoon, Yong Kyoung Yoo, Jeong Hoon Lee.

Fakultät für Elektrotechnik, Kwangwoon University, 20 Kwangwoon-ro, Nowon, Seoul, 01897, Republik Korea

Seong Jun Park, Seungmin Lee, Na Eun Lee, Jeong Soo Park, Ji Hye Hong und Jeong Hoon Lee

School of Biomedical Engineering, Korea University, 145 Anam-ro, Seongbuk, Seoul, 02841, Republik Korea

Seungmin Lee, Dongtak Lee, Ji Hye Hong, Jae Won Jang, Hyunji Kim und Dae Sung Yoon

Abteilung für Biotechnologie, Hochschule für Biowissenschaften und Biotechnologie, Korea University, Seoul, 02841, Republik Korea

Von Eun Lee

Interdisziplinäres Programm für Precision Public Health, Korea University, Seoul, 02841, Republik Korea

Jae Won Jang, Hyunji Kim und Dae Sung Yoon

Abteilung für Biotechnologie und Bioinformatik, Korea University, Sejong, 30019, Republik Korea

Seokbeom Roh & Gyudo Lee

Interdisziplinäres Graduiertenprogramm für künstliche Intelligenz und intelligente Konvergenztechnologie, Korea University, Sejong, 30019, Korea

Seokbeom Roh & Gyudo Lee

CALTH Inc., Changeop-ro 54, Seongnam, Gyeonggi, 13449, Republik Korea

Dongho Lee

Vaccine Bio Research Institute, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Republik Korea

Sung-Yeon Cho, Chulmin Park, Dong-Gun Lee, Raeseok Lee und Dukhee Nho

Abteilung für Infektionskrankheiten, Abteilung für Innere Medizin, Medizinische Fakultät, Katholische Universität Korea, Seoul, Republik Korea

Sung-Yeon Cho, Dong-Gun Lee, Raeseok Lee und Dukhee Nho

Astrion Inc., Seoul, 02841, Republik Korea

Dae Sung Yoon

Abteilung für Elektrotechnik, Katholische Kwandong-Universität, 24, Beomil-ro 579 beon-gil, Gangneung-si, Gangwon-do, 25601, Republik Korea

Yong Kyoung Yoo

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SJP, SL, DL (Dongtak Lee), DSY, YKY und JHL haben die Studie konzipiert und gestaltet. NEL, JSP und JHH führten die PCR-Experimente durch. DL (Dongtak Lee), JWJ und HK führten die Extraktion der roten Blutkörperchenmembran und die Materialcharakterisierung durch. SR und GL führten eine auf Kelvin-Sondenkraftmikroskopie basierende Materialcharakterisierung durch. DL (Dongho Lee), SC, CP, DL (Dong-Gun Lee), RL und DN stellten klinische Proben zur Verfügung und interpretierten die Ergebnisse. SJP, SL, DL (Dongtak Lee), YKY und JHL haben das Manuskript verfasst. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Dae Sung Yoon, Yong Kyoung Yoo oder Jeong Hoon Lee.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Olivier Vandenberg und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Park, SJ, Lee, S., Lee, D. et al. PCR-ähnliche Leistung eines Schnelltests mit permselektiv abstimmbarer Nanofalle. Nat Commun 14, 1520 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37018-6

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Eingegangen: 03. Oktober 2022

Angenommen: 24. Februar 2023

Veröffentlicht: 18. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37018-6

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