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Jan 09, 2024

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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4241 (2023) Diesen Artikel zitieren 424 Zugriff auf 2 Altmetric Metrics-Details Im Rahmen der COVID-19-Pandemie waren klinische Labore mit Problemen konfrontiert

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4241 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Im Zuge der COVID-19-Pandemie waren klinische Labore mit einem massiven Anstieg der Tests konfrontiert, was zu Probenentnahmesystemen, Reagenzien und Personalmangel führte. Wir haben selbst gesammelte Salzgurgelproben verwendet, um Hochdurchsatz-SARS-CoV-2-Multiplex-Polymerase-Kettenreaktionstests (PCR) zu optimieren und so Kosten und Zeit für den Techniker zu minimieren. Dies wurde durch den Wegfall der Nukleinsäureextraktion und die Automatisierung der Probenhandhabung auf einem weit verbreiteten Roboter-Liquid-Handler, Hamilton STARlet, erreicht. Um die Probenahme im Primärröhrchen zu ermöglichen, wurde ein maßgeschneidertes Barcode-Scan-Skript zum Lesen der Proben-ID durch das Hamilton STARlet-Softwaresystem entwickelt. Die Verwendung vorgefrorener SARS-CoV-2-Assay-Reaktionsmischungen verkürzte die Testaufbauzeit. Sowohl bei der Validierung als auch bei Live-Tests lieferte der Assay keine falsch positiven oder falsch negativen Ergebnisse. Von den 1060 Proben, die während der Validierung getestet wurden, mussten 3,6 % (39/1060) der Proben erneut getestet werden, da sie entweder ein einzelnes Gen positiv waren, ein internes Kontrollversagen oder einen Flüssigkeitsaspirationsfehler aufwiesen. Obwohl die Gesamtbearbeitungszeit im automatisierten Arbeitsablauf nur geringfügig schneller war (185 Minuten gegenüber 200 Minuten), konnte die praktische Zeit um 76 % reduziert werden, was möglicherweise zu einer Verringerung der Ermüdung und des Burnouts des Personals führte. Dieser beschriebene Prozess von der Probenselbstentnahme bis zum automatisierten direkten PCR-Test reduziert die Gesamtbelastung der Gesundheitssysteme hinsichtlich Personal und Reagenzienbedarf erheblich.

Die Entnahme von Nasopharyngealabstrichproben (NPS) gilt immer noch als Goldstandard für den diagnostischen Nachweis von SARS-CoV-21,2. Diese Art der Probenentnahme hat Nachteile, wie zum Beispiel Unannehmlichkeiten für den Patienten und ist ressourcenintensiv, da ein engagierter Mitarbeiter im Gesundheitswesen erforderlich ist, um den Probenentnahmeprozess genau zu sammeln oder zu überwachen. Eine schlechte Leistung der NPS-Probenahme kann aufgrund einer unzureichenden/unsachgemäßen Probenentnahme zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Um dieses Problem anzugehen, wurde während der COVID-19-Pandemie aktiv nach alternativen Probentypen gesucht, die einfach zu verabreichen sind, vorzugsweise durch Selbstentnahme. Speichel war der erste nicht-invasive, nicht-NPS-Probentyp, der validiert wurde und eine ähnliche Leistung wie der Goldstandard-NPS-Probentyp aufwies3,4,5,6. Die empirische Beobachtung, dass das SARS-CoV-2-Virus in dieser Matrix > 72 Stunden lang stabil ist7 und daher keine speziellen Entnahmegeräte oder Konservierungsmittel erfordert, eröffnete Möglichkeiten für die Durchführung einer selbst verabreichten Probenentnahme zu Hause. Die Entwicklung „extraktionsfreier“ PCR-Protokolle8,9, bei denen der Speichel ohne aufwändige RNA-Reinigung direkt zum RT-qPCR-Assay-Reaktionsgemisch hinzugefügt wird, hat die klinische Akzeptanz dieses Probentyps weiter verbessert5. Dies führte dazu, dass die Federal Drug Administration (FDA) Speichelproben und ein direktes PCR-Protokoll für Speicheltests, genannt Saliva Direct10, für den SARS-CoV-2-Nachweis gemäß den EUA-Vorschriften (Emergency Use Authorization) genehmigte.

Ungeachtet der Vorteile von Speichel als vereinfachte Alternative zur NPS-Probenahme hat sich seine praktische Umsetzung für den Hochdurchsatz-SARS-CoV-2-Nachweis für diagnostische Labore als Herausforderung erwiesen11. Roher Speichel ist zähflüssig und kann kurz nach der Entnahme erstarren6. Dies erschwert das manuelle Pipettieren oder das Pipettieren mit einem automatischen Liquid-Handler. Zur Verringerung der Viskosität sind diskrete Schritte erforderlich, darunter die Verdünnung in spezifischen Puffern4,12,13 oder die Inkubation mit Proteinase-K5, gefolgt von einer Wärmebehandlung (95 °C für 30 Minuten), um das Deproteinisierungsmittel zu inaktivieren. Diese präanalytischen Schritte sind zwar einfach umzusetzen, müssen jedoch manuell durchgeführt werden, was eine zusätzliche Arbeitsbelastung für ein klinisches Labor bedeutet. Um dies zu mildern, wurde die Sammlung von Speichel in einem flüssigen Medium wie universellen/viralen Transportmedien (UTM/VTM) vorgeschlagen14. Die hemmende Natur dieser Verflüssigungs-/Stabilisierungsmittel erschwert jedoch die Umsetzung des ursprünglichen Saliva Direct-Protokolls und zwingt Diagnoselabore dazu, Speichelproben mit Standard-RNA-Reinigungsmethoden zu verarbeiten15,16,17. Dieser Testweg ist nicht nur zeitaufwändig, sondern steht auch im Widerspruch zu den ursprünglichen Zielen des Saliva Direct-Protokolls, das darauf abzielte, SARS-CoV-2-Tests erschwinglich zu machen, insbesondere für ressourcenbeschränkte Umgebungen.

In der zweiten Hälfte des Jahres 2020 berichteten zwei Gruppen18,19 unabhängig voneinander über die Verwendung von salzhaltigen Mundspülungen (Salzgurgeln) zum Nachweis des Vorhandenseins von SARS-CoV-2. Die Entnahme dieses Probentyps, der fortan als Kochsalzlösungsgurgeln bezeichnet wird, konnte sowohl bei Erwachsenen als auch bei Kindern (in der Regel > 4 Jahre) ohne die Notwendigkeit eines speziellen HCW durchgeführt werden, während ihre Leistung im Vergleich zu HCW-gesammelten NPS20,21 erhalten blieb. Dadurch wurde mehr Zeit frei klinische Ressourcen und eingesparte NPS-Sammelgeräte, die zu diesem Zeitpunkt äußerst knapp waren22. Weitere Studien zeigten, dass das Gurgeln mit Kochsalzlösung auch für eine extraktionsfreie PCR geeignet ist, im Gegensatz zu Speichel jedoch aufgrund seiner wasserähnlichen Konsistenz keine komplexe voranalytische Verarbeitung erfordert23,24. Die Einfachheit dieses Prozesses eröffnete die Möglichkeit, den Testprozess an einem Liquid Handler zu automatisieren. Das Ziel der vorliegenden Studie bestand daher darin, die Optimierung und Implementierung des Spike/ORF8/RNaseP (SORP)-Multiplex-PCR-Tests im Gurgel-Direct-PCR-Format (GDirect-PCR) auf einer automatisierten Liquid-Handling-Plattform – dem Microlab STARlet ( Hamilton Robotics, NV, USA) Liquid-Handling-System, im Folgenden als Hamilton GDirect-PCR (HGDirect-PCR) bezeichnet.

Erste Tests zur Durchführbarkeit der Direkt-PCR an Salzgurgelproben wurden an einer Kohorte von 38 positiven und 75 negativen SARS-CoV-2-Proben unter Verwendung von zwei Tests durchgeführt – dem N1/N2 US-CDC und dem SORP (Version 1). Der Nucleocapsid-Assay des US-CDC detektierte die N1-Ziele in den 38 positiven Salzgurgelproben mithilfe der GDirect-PCR-Methode; Allerdings waren vier Proben fälschlicherweise negativ für das N2-Ziel (Probennummer: FS5, FRS10, FRS16 und FRS18) (Tabelle 1). Als dieselben Proben mit dem standardmäßigen RNA-Extraktionsprotokoll getestet wurden, wurden keine falsch negativen Ergebnisse aufgezeichnet. Der mittlere Anstieg des CT-Werts zwischen dem standardmäßig extrahierten RNA- und dem Direkt-PCR-Ansatz für N1- und N2-Genziele betrug 2,74 bzw. 5,74. Die interne Kontrolle RNaseP wurde in allen positiven und negativen Gurgelproben sowohl mit Standard- als auch mit extraktionsfreien Methoden nachgewiesen.

Als dieselben 38 positiven Salzgurgelproben mit dem SORP-Assay (Version 1) unter Verwendung des Standard-RNA-Extraktionsprotokolls getestet wurden, wurden in allen Proben sowohl S- als auch ORF8-Genziele nachgewiesen, einschließlich der internen RNaseP-Kontrolle (Tabelle 1). Beim Test mit der GDirect-PCR wurden sowohl S als auch ORF8 in allen bis auf zwei Proben nachgewiesen: FRS15 (Spike- und ORF8-negativ) und FRS18 (Spike-negativ, ORF8-positiv) (Tabelle 1). Der mittlere Anstieg des CT-Werts zwischen dem standardmäßig extrahierten RNA- und dem Direkt-PCR-Ansatz für S- und ORF8-Genziele betrug 4,24 bzw. 2,63. Unter den 75 SARS-CoV-2-negativen Gurgelproben, die mit dem GDirect-PCR-Protokoll getestet wurden, wurden keine falsch positiven Ergebnisse festgestellt. Dies ergab für den GDirect-PCR-Prozess eine positive prozentuale Übereinstimmung von 97,37 % (95 %-KI 86,2–99,9 %) und eine Gesamtübereinstimmung von 99,12 % (95 %-KI 95,2–99,9 %) in Bezug auf den Referenztest.

Als wir den ursprünglichen SORP-Assay (Version 1) auf eine Kohorte (n = 200) SARS-CoV-2-positiver Salzgurgelproben anwendeten, stellten wir zwei Probleme fest (a.) Verlust des Spike-Genziels bei etwa 7 % der Proben positive Proben und (b.) starkes RNaseP-Signal aus klinischen Proben (CT = 18–28). Während das Vorhandensein großer Mengen menschlicher Zellen in den Salzgurgelproben das starke RNaseP-Signal erklärt, war der häufige Ausfall des Spike-Gen-Ziels unerwartet. Als dieselben Einzelziel-positiven (S-/ORF8+)-Proben mit extrahierter RNA erneut getestet wurden, wurde durchweg eine positive Amplifikation für das Spike-Gen festgestellt. Eine Manipulation der einzelnen Konzentrationen der Spike-F1/-R1-Primer und der Spike-P1-Sonde konnte das Problem nicht beheben (Daten nicht gezeigt).

Die optimale Annealing-Temperatur wurde mittels Temperaturgradienten-PCR (60 °C bis 68 °C) an einer Kohorte positiver Salzgurgelproben bestimmt (Abb. 1). Während die Annealing-Temperatur (60 °C bis 63 °C) keinen nennenswerten Einfluss auf das Amplifikationsprofil des ORF8-Zielgens hatte, zeigte das Spike-Gen eine optimale Amplifikation bei Annealing-Temperaturen von > 65 °C (Abb. 1). Dies deutete darauf hin, dass die PCR-Annealing-Temperatur von 60 °C, die im ursprünglichen SORP-Version-1-Assay für gereinigte RNA-Matrizen eingestellt war, für Kochsalzgurgel-Matrizen, die unter direkten PCR-Bedingungen verwendet wurden, nicht optimal war. Als RNA aus Salzgurgelproben extrahiert und als gereinigte Matrize verwendet wurde, amplifizierten beide S/ORF8-Ziele optimal bei 60 °C (Abb. 4_suppl) und jede Abweichung von dieser Temperatur (> 60 °C) führte zu einer allmählichen Abnahme im Detektionssignal dieser beiden Ziele. Dies deutete darauf hin, dass die Leistung des Spike-Gen-Ziels sowohl von der Temperatur als auch von der Art der Eingabevorlage (gereinigte RNA vs. ungereinigtes Gurgeln mit Kochsalzlösung) beeinflusst wurde. Die ORF8-Verstärkung wurde durch die Art der Eingabevorlage nicht beeinflusst, aber ein Temperaturanstieg von den optimalen 60 °C führte zu einer Dämpfung des Verstärkungssignals (Abb. 4_Suppl).

Repräsentatives Beispiel aus drei Salzgurgelproben, die mittels extraktionsfreier PCR unter Verwendung des SORP ver:1-Assays getestet wurden. Variation der Signalintensität des S- und ORF8-Gens bei unterschiedlichen Annealing-Temperaturen (60 °C bis 68 °C), quantifiziert in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU). Gemäß den Angaben des Herstellers des Luna Probe One-Step RT-qPCR-Mix wurden 60 °C als optimale Annealing-Temperatur angesehen und als Referenztemperatur verwendet.

Um die suboptimale Leistung des Spike-Gen-Ziels zu beheben, haben wir den ursprünglichen Spike-Forward-Primer Spike-F123 gekürzt, was zu seiner optimalen Amplifikation bei 60 °C in der GDirect-PCR führte (Abb. 5_suppl). Dieser neue verkürzte Spike-Primer mit der Bezeichnung Spike-F1-M4 ersetzte den ursprünglichen Spike-F1-Primer. Die Anwendung des neuen Spike-F1-M4 führte zu einer optimalen Amplifikation sowohl der Spike- als auch der ORF8-Genziele bei einer Annealing-Temperatur von 60 °C in der GDirect-PCR.

Der neue RNaseP R-3-Primer mit geringer Effizienz führte zu einem schwächeren Signal (Anstieg der durchschnittlich 3–4 CT-Werte) in der menschlichen DNA-Kontrolle, wenn er an einer Kohorte (n = 12) negativer Gurgelproben getestet wurde (Abb. 6_suppl). Die Verwendung des Spike-F1-M4-Primers mit den schwächeren RNaseP-Amplifikationsprimern verbesserte den Nachweis beider S/ORF8-Ziele beim Testen an zuvor positiven SARS-CoV-2-Gurgelproben (Abb. 7_suppl).

Die einstündige Hitzeinaktivierung der Salzgurgelproben bei 65 °C führte nicht zu einem signifikanten Verlust des E-Gen-Signals (Abb. 2). Die mittlere CT-Änderung betrug ΔCT = + 0,16 vor und nach dem Erhitzen. Der mittlere ΔCT betrug – 0,26 und – 0,17, wenn dieselbe Kohorte erhitzter Proben vor dem Test 24 Stunden lang bei 4 °C bzw. Raumtemperatur gelagert wurde.

Variation des E-Gen-Signals aus Salzgurgelproben, die nach Hitzeinaktivierung (65 °C für 60 Minuten) auf SARS-CoV-2 getestet wurden. Ein Aliquot der erhitzten Probe wurde vor dem E-Gen-Nachweis 24 Stunden lang bei 4 °C und Raumtemperatur (RT) gelagert. Kontrolle = Originalprobe, die unmittelbar nach der Hitzeinaktivierung getestet wurde.

In einem 96-Well-Plattenlauf mit 92 Replikatproben betrugen die durchschnittlichen CT-Werte der Spike- und ORF8-Genziele 28,56 (SD = 0,10) bzw. 29,35 (SD = 0,10). Der Variationskoeffizient der CT-Werte für die Genziele Spike und ORF8 betrug 0,35 %. Im Schachbrett-Ausgabeschema wurde keine Kreuzkontamination festgestellt.

In der ersten Phase der Validierung wurden insgesamt 908 klinische Salzgurgelproben parallel im Referenztest und im HGDirect-PCR-Workflow über einen Zeitraum von 10 Tagen getestet. Die Ergebnisse der HGDirect-PCR-Ergebnisse wurden aufgezeichnet und unter Verwendung eines Algorithmus interpretiert, wie in Abb. 3 dargestellt. Der HGDirect-PCR-Workflow erkannte 78 positive Ergebnisse (S+/ORF8+) von den insgesamt 87 positiven Ergebnissen, die durch den Referenztest nachgewiesen wurden (Tabelle 2). . Von den verbleibenden 9 positiven Proben waren 6 Proben positiv für ein einzelnes Genziel (S oder ORF8), was sie „unbestimmt“ („IND“) machte, während 3 Proben aufgrund eines Fehlers bei der Flüssigkeitsabgabe auf dem Hamilton Starlet Instrument kein Ergebnis lieferten („IVLD“) (Tabelle 2). Von den 821 Proben, die im Referenztest negativ getestet wurden, wurden 793 vom HGDirect-PCR-Workflow als negativ (S-/ORF-/RNaseP+) klassifiziert (Tabelle 2). Die verbleibenden 28 Proben lieferten ein abweichendes Ergebnis: 11 Einzelgen-Positive („IND“), 10 RNaseP-Fehler („IVLD“) und 7 Flüssigkeitsabgabefehler („IVLD“). Siebenunddreißig Proben der insgesamt 908 im HGDirect-PCR-Workflow getesteten Proben hätten zur Ergebnisbestätigung einen erneuten Test (Tabelle 2) erfordert, was einer Wiederholungstestrate von 4,07 % (37/908) entspricht. Beim HGDirect-PCR-Workflow wurden keine falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnisse aufgezeichnet, was diesem Testverfahren eine Sensitivität und Spezifität von 100 % und eine Nachweisgenauigkeit von 95,9 % verleiht, vorausgesetzt, dass ein bestätigender erneuter Test von Proben durchgeführt wurde, die ein IND/IVLD-Ergebnis lieferten.

Interpretationsalgorithmus für den HGDirect-PCR-Workflow. Proben, die entweder ein IND-Ergebnis (unbestimmt) oder ein IVLD-Ergebnis (ungültig) lieferten, wurden zur erneuten Prüfung mit dem XpertXpress- oder BDMax SARS-CoV-2-Assay eingereicht.

Bei der Live-Anwendung des HGDirect-PCR-Tests an 152 Gurgelproben mit Kochsalzlösung wurden 8 positive (8/152) und 144 negative (144/152) festgestellt, mit 2 nicht übereinstimmenden Ergebnissen (Tabelle 3). Bei diesen beiden nicht übereinstimmenden Ergebnissen handelte es sich um ein einzelnes Gen positives Ergebnis („IND“) oder um einen RNaseP-Nachweisfehler („IVLD“), was zu einer Testfehlerrate von 1,3 % führte. Diese widersprüchlichen Ergebnisse wurden mit dem Xpert Xpress SARS-CoV-2-Assay sofort behoben und als negativ befunden.

Für die Verarbeitung von 91 Salzgurgelproben bis zur PCR-Zyklusphase benötigte der Techniker im HGDirect-PCR-Workflow durchschnittlich 125 Minuten, wovon nur 30 Minuten auf die tatsächliche praktische Zeit entfielen (Abb. 4). Im Gegensatz dazu benötigte der Techniker bei der Standardmethode 155 Minuten, davon 130 Minuten praktische Zeit (Abb. 4), um 91 Proben einzurichten. Wenn die PCR-Zykluszeit einbezogen wurde, dauerte der Standardprozess 200 Minuten, während die HGDirect-PCR 185 Minuten benötigte, um eine Charge von 91 Salzgurgelproben zu verarbeiten.

Erforderliche Rüstzeit (Min.) für die Verarbeitung von 91 Salzgurgelproben im (a) KingFisher-Verfahren („Standardverfahren“) und (b) Hamilton-Direct-Verfahren („HGDirect-PCR“). Setup-Zeit (abzüglich PCR-Zyklus) erforderlich für (a) KingFisher-Prozess = 155 Min. (Hands-on-Zeit = 130 Min.) und (b) HGDirect-PCR = 125 Min. (Hands-on-Zeit = 30 Min.). Die Gesamtzeit (Einrichtung + PCR-Zyklus) für KingFisher und HGDirect-PCR beträgt 200 Minuten bzw. 185 Minuten.

Seit COVID-19 Anfang März 2020 von der WHO zur weltweiten Pandemie erklärt wurde, sahen sich Diagnostiklabore mit einer beispiellosen Nachfrage konfrontiert, ihre Testkapazitäten zu erhöhen, was zu Personal- und Reagenzienengpässen führte. Um die Laboreffizienz zu steigern, haben wir einen einfacheren direkten PCR-Assay entwickelt, der eine Extraktion überflüssig macht, und den Prozess automatisiert, um die Vorteile des Primärröhrchentests zu nutzen. In früheren Berichten wurden Direct-PCR-Methoden mit manuellen Methoden beschrieben, diese sind jedoch repetitiv, zeitaufwändig und tragen zur Ermüdung des Personals bei. Interessanterweise haben bisher nur wenige Studien die Vorteile der Implementierung eines automatisierten Liquid Handlers in einem extraktionsfreien PCR-Testworkflow beschrieben. In einer Studie von Blairon et al.25 wurde die Nimbus-Extraktionsplattform, Teil des Allplex SARS-CoV-2 Assay RT-qPCR-Testsystems (Seegene Technologies, Korea), neu konfiguriert, um einen Vorverdünnungsschritt des klinischen Tests durchzuführen Probe, gefolgt von der Dosierung in die Testmischung, was sowohl zu einem verbesserten Durchsatz (86,4 vs. 97,8 %) als auch einer Durchlaufzeit (19:18 h vs. 09:03 h) im Vergleich zum manuellen Verfahren führt. Während in dieser Studie der UTM-Probentyp verwendet wurde, ist uns keine andere Studie bekannt, in der ein Liquid-Handling-System für die extraktionsfreie PCR-Verarbeitung am Probentyp „Salzgurgeln“ verwendet wurde.

Ein zusätzlicher Vorteil des automatisierten Prozesses war die Verwendung von Primärröhrchentests. Um dies umzusetzen, haben wir zwei Änderungen in unserem Arbeitsablauf vorgenommen: (1.) An den Röhrchen wurden eindeutige Barcode-Etiketten angebracht, die vom Scansystem des Hamilton STARlet gelesen werden konnten, und (2.) wir haben die Proben hitzeinaktiviert (65 °C). C für 60 Minuten) in den primären Sammelröhrchen, so dass sie sicher auf der offenen Plattform von Hamilton in einem Standardlabor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) verarbeitet werden konnten. Die niedrigere Temperatur von 65 °C bei längerer Dauer wurde aufgrund von Bedenken hinsichtlich der Integrität der primären Probensammelröhrchen bei 95 °C gewählt, was zwar schneller ist, sich aber negativ auf das Downstream-PCR-Signal auswirkt26,27.

Unserer Erfahrung nach war die Wahl und Optimierung des SARS-CoV-2 RT-qPCR-Multiplex-Assays entscheidend für den letztendlichen Erfolg des extraktionsfreien PCR-Prozesses. Dies liegt daran, dass die bisher veröffentlichten SARS-CoV-2-RT-qPCR-Multiplex-Assays für gereinigte SARS-CoV-2-RNA-Matrizen entwickelt wurden. Der direkte Einsatz dieser Multiplex-Assays in einem extraktionsfreien Arbeitsablauf kann zu einer suboptimalen Amplifikation führen. Beispielsweise haben Vogel et al. (2020) stellten einen zufälligen Ausfall des N2 SARS-CoV-2-Zielgens fest, als der vom US-CDC zugelassene N1/N2-Multiplex-Assay auf Speichelvorlagen angewendet wurde. Daher basiert das von der FDA und EUA lizenzierte Saliva Direct-Protokoll auf einer einzelnen SARS-CoV-2-N1-Gen-PCR (mit menschlichem RNaseP als Probenkontrolle) zum Nachweis von SARS-CoV-210. Ähnliche Beobachtungen wurden auch bei anderen Extraktionen gemacht -freie PCR-Studien, bei denen bestimmte SARS-CoV-2-Multiplex-Kombinationen zu niedrigeren Erkennungsraten geführt haben. Beispielsweise hatten E/N1-Genziele in Multiplex-Kombination eine Erkennungsrate von ~ 70 % im Vergleich zu ORF1ab/N1 oder ORF1ab/N2, die eine analytische Sensitivität von > 98 % aufwiesen26. Wir stellten auch eine schlechte Leistung unseres ursprünglichen S/ORF8-Assays fest, bei dem im GDirect-PCR-Workflow ein zufälliger Ausfall des S-Gen-Ziels beobachtet wurde. Dieses Problem wurde jedoch behoben, als der Assay erneut optimiert wurde (SORP Version 2). Wir möchten auch hinzufügen, dass aufgrund der häufig beobachteten Mutationen im S-Gen (https://covariants.org/) die Möglichkeit besteht, dass S-Gen-Ausfälle (S-/ORF8+) beobachtet werden. Das Erhalten dieses Ergebnisses würde unweigerlich zu einer übermäßigen Belastung durch zusätzliche Bestätigungstests gemäß unserem Testalgorithmus führen (Abb. 3). Unter solchen Umständen bestünde die umsichtigste Abhilfemaßnahme darin, eine detaillierte In-silico-Analyse des Primer-/Sondensatzes des S-Gens durchzuführen und mögliche Änderungen an seiner Sequenz vorzunehmen.

Die durch den HGDirect-PCR-Prozess gesteigerte Testeffizienz muss mit der Notwendigkeit verstärkter Bestätigungstests in Einklang gebracht werden. Von den 908 Gurgelproben, die während der HGDirect-PCR-Validierung getestet wurden, mussten 4,07 % (37/908) der Proben erneut getestet werden.

Diese Studie weist Einschränkungen auf. Wir haben NPS-Proben nicht auf unserem HGDirect-PCR-System getestet. Dies lag daran, dass die Spitzen der Liquid-Handler-Pipette des Hamilton STARlet häufig mit den Tupferstäbchen kollidierten, die sich noch in den Primärprobenröhrchen befanden. Obwohl eine Möglichkeit, dies zu umgehen, darin bestünde, die UTM/VTM-Flüssigkeit in ein Röhrchen zu geben, das keinen Tupfer enthält, hätte dies einen zusätzlichen zeitaufwändigen und mühsamen Schritt bedeutet, der einen Großteil der Vorteile des automatisierten Prozesses zunichte gemacht hätte. Eine zusätzliche Einschränkung dieser Studie ist der Vergleich des bestehenden manuellen Extraktionsprozesses mit dem automatisierten Direkt-PCR-Prozess. Eine Alternative wäre die Automatisierung des Ladens von Proben in das Standard-Extraktionsgerät gewesen, die nach Abschluss der Studie implementiert wurde. Dies hatte einige zusätzliche Vorteile durch eine kürzere Bearbeitungszeit.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass direkte extraktionsfreie PCR-Tests zum SARS-CoV-2-Nachweis aus Primärröhrchen auf einem Liquid Handler wie dem Hamilton STARlet durchgeführt werden können. Bei sorgfältiger Optimierung kann die Direkt-PCR zuverlässig in einen automatisierten Arbeitsablauf implementiert werden, was dem Techniker Zeit spart und möglicherweise die Ermüdung des Personals bei Tests mit hohem Volumen verringert. Der hier beschriebene Prozess könnte für klinische Labore von Interesse sein, die einen Liquid Handler für die Durchführung einer extraktionsfreien SARS-CoV-2-PCR in großen Mengen integrieren möchten.

Es wurden klinische Proben verwendet, die für routinemäßige SARS-CoV-2-Tests in den Microbiology & Virology Laboratories des BC Children's Hospital (BCCH) eingereicht wurden. Proben wurden von symptomatischen Kindern und Erwachsenen, einschließlich Mitarbeitern des Gesundheitswesens, in unserer hauseigenen COVID-19-Testklinik sowie in einer gemeindebasierten Drive-in-COVID-19-Testklinik entnommen. Wie zuvor beschrieben18, wurden die Patienten angewiesen, sich ein Lehrvideo (http://y2u.be/V9xonNTtApY; http://y2u.be/ZvqjkbD-moA) zur Selbstentnahme der Probe anzusehen und erhielten das Entnahmekit. Die Proben wurden innerhalb von 1–6 Stunden nach der Entnahme an das Labor weitergeleitet. Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und die Studie wurde vom Research Ethics Board der University of British Columbia (H20-02538) genehmigt. Restproben wurden vor der Verwendung anonymisiert und für die Zwecke dieser Assay-Validierungsstudie wurde auf die Einwilligung verzichtet.

Der im Labor für Mikrobiologie und Virologie verwendete primäre SARS-CoV-2-Test wurde vom Public Health Laboratory am British Columbia Center for Disease Control (BCCDC) entwickelt. Dieser Assay zielte auf die RdRp- und E-Gene von SARS-CoV-2 ab, mit der menschlichen RNaseP als interner Kontrolle28. Dieser Test, der im Folgenden als „Referenztest“ bezeichnet wird, wurde routinemäßig zum Testen klinischer Proben verwendet. Die für diesen Test verwendete Gesamtnukleinsäure (TNA) wurde auf dem automatisierten Extraktionsgerät KingFisher Flex (ThermoFisher, Carlsbad, CA) unter Verwendung des MagMAX Viral Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit (ThermoFisher) gemäß den Empfehlungen des Herstellers gereinigt. Fünf Mikroliter des endgültigen TNA-Eluats (50 µL), das in der KingFisher-96-Well-Platte abgegeben wurde, wurden für den RT-qPCR-Assay auf die ABI-Platte übertragen. Dieser Arbeitsablauf, der im Folgenden als „Standardextraktionsprozess“ bezeichnet wird, ist in Abb. 4 zusammengefasst.

Die ersten Tests zur extraktionsfreien PCR wurden an einer Kohorte von 38 SARS-CoV-2-positiven und 75 negativen Salzgurgelproben durchgeführt, die zuvor mit dem Standard-Extraktionsassay getestet wurden. Die Proben wurden zur Virusinaktivierung 60 Minuten lang in einen Labor-Konvektionsofen bei 65 °C gestellt und dann 10 Minuten lang auf Raumtemperatur (RT) abgekühlt. 5 µL der primären Gurgelprobe wurden dann direkt manuell in die RT-qPCR-Reaktion gegeben. Für die Tests wurden zwei separate SARS-CoV-2-Multiplex-Assays verwendet: der Spike-ORF8 (SORP)-Triplex-Assay23 und der Nucleocapsid-Assay2 des N1/N2 US-CDC.

Der ursprüngliche SORP-Triplex-PCR-Assay23 musste vor seiner Implementierung auf dem HGDirect-PCR modifiziert werden. Insbesondere wurde der ursprüngliche Spike-F1-Primer gekürzt, um einen neuen Primer, Spike-F1-M4, zu ergeben, und der mRNA-RNaseP-Targeting-RNaseP-R8-Reverse-Primer wurde durch einen neuen Primer RNaseP-R3 ersetzt (siehe Ergebnisse oben). Der modifizierte SORP-Assay wird als „SORP ver: 2“ (Tabelle 4) bezeichnet, um ihn vom ursprünglichen SORP-Assay23 zu unterscheiden, der im Folgenden als „SORP ver: 1“-Assay bezeichnet wird.

Die Direkt-PCR wurde mit dem Luna Probe One-Step RT-qPCR-Mix (Kat.-Nr.: E3006E; New England Bio labs, Whitby, ON) durchgeführt. Fünf μL der Salzgurgelprobe wurden zu 25 μL des Assay-Reaktionsgemisches hinzugefügt, das aus Folgendem bestand: 12,5 μL Luna-Sondenmischung (2X), 1,25 μL Reverse Transkriptase (20X), Spike-F1-M4/R1-Primer (jeweils 0,4 μM). ), Spike-P1-Sonde (0,2 μM), ORF8-F1/ORF8-R-Primer (0,4 μM), ORF8-P-Sonde (0,2 μM), RNaseP-F/R3-Primer (0,2 μM) und RNaseP-P-Sonde (0,2 μM). μM). Die 96-Well-RT-qPCR-Reaktionsplatte wurde auf einem ABI Digital Vortex-Genie 2 Shaker (Cole Palmer, Montreal, QC) gevortext (800 U/min für 1 Minute), um die Reaktionskomponenten zu mischen. Die Zyklusbedingungen für die direkte PCR waren: 55 °C für 5 Minuten, 60 °C für 5 Minuten (Reverse Transkription), 95 °C × 60 s (Enzymaktivierung), gefolgt von 50 Zyklen von 95 °C bei 10 s und 60 s °C bei 60 s. Thermocycling und Fluoreszenzerfassung wurden mit dem QuantStudio 6Pro-Instrument (ThermoFisher) durchgeführt. Aus Gründen der Betriebseffizienz wurde zuvor in großen Chargen ein SARS-CoV-2 Luna RT-qPCR-Mastermix (enthaltend S-, ORF8- und RNaseP-Primer und -Sonden sowie das Reverse-Transkriptase-Enzym) hergestellt. Jede Charge (vordosiert in 2-ml-Röhrchen, ausreichend für eine 96-Well-Platte) wurde einer Qualitätskontrolle unterzogen und bei -80 °C gefroren gelagert.

Um eine Konkurrenz zwischen der internen Kontroll-PCR und viralen PCRs in schwach positiven klinischen Proben zu vermeiden, wurde ein neuer Reverse-Primer, RNaseP-R1, etwa 89 bp stromabwärts des RNaseP-R-Primers des US-CDC (Abb. 1_Suppl) für den routinemäßigen Einsatz entwickelt Britisch-Kolumbien. Eine verkürzte Version des RNaseP-R1-Primers wurde individuell synthetisiert, indem sechs Basen an seinem 3ʹ-Ende gelöscht wurden. Dieser neue Primer mit der Bezeichnung RNaseP-R3 (Abb. 1_Suppl) wurde an einer praktischen Probe getestet, die aus einem Pool von Salzgurgelproben bestand, die zuvor mit dem Referenztest (E/RdRp/ RNaseP).

Eine Kohorte von 9 Salzgurgelproben, die zuvor positiv auf SARS-CoV-2 getestet wurden, wurde zur Untersuchung der Auswirkung der Hitzeinaktivierung auf das endgültige RT-qPCR-Signal verwendet. Einzelne Gurgelproben wurden wie zuvor beschrieben hitzeinaktiviert. Aliquots wurden vor dem Erhitzen, Nachkühlen und anschließender 24-stündiger Lagerung bei 4 °C und RT aufbewahrt. Die Aliquots wurden zur RNA-Extraktion und PCR für das SARS-CoV-2-E-Gen29 eingereicht.

Nach der Anmeldung der Patientenproben mit dem SunQuest 6.4-System (Sunquest Information System, Tucson, AZ) wurden Barcode-Etiketten mit einer eindeutigen Probennummer auf den Primärprobenröhrchen angebracht (Abb. 2_Suppl). Chargen von 91 Röhrchen wurden dann 60 Minuten lang bei 65 °C inkubiert, um das SARS-CoV-2-Virus26,30 zu inaktivieren, und dann 10 Minuten lang auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschließend wurden die Röhrchenkappen entfernt, während die Röhrchen in vier Hamilton-Racks mit je 24 Röhrchen geladen wurden (Abb. 2_Suppl). Im letzten Rack wurden zwei Positiv- und Negativkontrollen geladen.

Die Barcodes der Röhrchen wurden beim Laden mit dem integrierten Röhrchenscanner des Hamilton STARlet gescannt. Um möglicherweise falsch angebrachte Etiketten zu handhaben, wurde eine Scanmethode geschrieben, die Probenröhrchen markiert, die nicht gescannt werden konnten, und dem Bediener die Möglichkeit gibt, das Probenröhrchen mit einem Handscanner zu drehen und erneut zu scannen oder die Probennummer über die Tastatur einzugeben. Die Methode schrieb dann drei Microsoft Excel-Dateien mit IDs und Plattenpositionen für (a.) alle Übertragungen, (b.) alle erfolgreichen Übertragungen und (c.) alle fehlgeschlagenen Übertragungen. In Microsoft Excel 2016 wurde ein Makro-Dienstprogramm erstellt, um die Proben-Barcode-Daten zu akzeptieren und in ein 96-Well-PCR-Plattenformat umzuwandeln, um sie in die Design- und Analysesoftware Version 2.6 (ThermoFisher) des QuantStudio 6Pro-Instruments zu importieren. In unserem Workflow war diese Excel-Makroschnittstelle auf dem PC-Computer vorinstalliert, der das QuantStudio 6Pro-Instrument steuerte.

Angesichts der Größe des Primärröhrchens erforderte die Übertragung von 5 µl Kochsalzlösung zum Gurgeln auf die RT-qPCR-Reaktionsplatte zwei Pipettierschritte (Abb. 2_suppl). Im ersten Schritt wurden 100 µl der Salzgurgelprobe mit einer Pipettenspitze mit einem Fassungsvermögen von 1000 µl in eine Zwischenplatte (ABGene 1400 96-Well-Platte; ThermoFisher) überführt. Nach diesem Transfer wurden 5 µL Salzgurgelmittel von der Zwischenplatte mit einer Spitze mit einem Volumen von 10 µl in die RT-qPCR-Assay-Mischung abgegeben.

Bei der ersten Übertragung wurde die Flüssigkeitsklasse HighVolumeFilter_Glycerin80_DispenseSurface_Empty von Hamilton mit den folgenden Modifikationen verwendet: Die Erfassung des Flüssigkeitsstands erfolgte nur durch Druck (auf hohe Empfindlichkeit eingestellt), wobei die kapazitive Erfassung ausgeschaltet war, um eine Auslösung durch Oberflächenblasen zu vermeiden. Ein Transportluftspalt von 10 µl erwies sich als optimal, um die Tröpfchenbildung zu verhindern, ohne eine Umkehrung der Luft-Flüssigkeits-Grenze innerhalb der Spitzen zu ermöglichen. Bei der 10-µl-Dispensierung wurde die gleiche Flüssigkeitsklasse verwendet, jedoch mit aktivierter kapazitiver Sensorik und einem 2-µl-Transportluftspalt.

Vor Beginn der Validierung des extraktionsfreien PCR-Assays mit dem Hamilton STARlet Liquid Handler wurden zwei Qualitätsparameter bewertet (1.) die Pipettiergenauigkeit zwischen den Wells und (2.) die Bewertung der Kreuzkontamination.

Für die Pipettiergenauigkeit zwischen den Wells wurde ein Pool positiver Proben (CT: 18–20) verwendet. Diese Probe wurde wie zuvor beschrieben hitzeinaktiviert und in 200 ml Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) verdünnt, um einen endgültigen CT-Wert von 27–29 zu ergeben. Zwei ml-Aliquote dieser verdünnten positiven Gurgelprobe wurden dann manuell in 92 primäre Gurgelsammelröhrchen mit eindeutigen Barcode-Etiketten verteilt und in den Probenständern des Hamilton STARlet platziert. Nach der Abgabe der Probe (5 µL) durch den Liquid Handler in das SORP Version 2 RT-qPCR-Reaktionsgemisch wurde die PCR durchgeführt und die CT-Werte des S/ORF8-Signals von jeder der 92 Reaktionen aufgezeichnet. Als Maß für die Präzision wurden der mittlere CT, die Standardabweichung und der Variationskoeffizient berechnet.

Zur Beurteilung der Kreuzkontamination wurde ein „Schachbrett“-Abgabeprofil (Abb. 3_Suppl) verwendet. Um dieses Abgabeprofil zu erreichen, wurde eine Kohorte SARS-CoV-2-positiver Gurgelproben (n = 12) in jedes der vier Ladegestelle des Hamilton STARlet an der 10., 13. und 16. Position eingefügt (beachten Sie, dass das Hamilton STARlet lädt). die Platten vertikal, nicht horizontal). In den übrigen Positionen wurden SARS-CoV-2-negative Salzgurgelproben (n = 80) geladen (Abb. 3_Suppl).

In der ersten Phase der Validierung wurden im Mikrobiologie- und Virologielabor des BCCH für SARS-CoV-2-Tests erhaltene Salzgurgelproben mit dem HGDirect-PCR-Workflow unter Verwendung des SORP-Version: 2-Assays getestet (Abb. 4). Diese anonymisierten Proben wurden zuvor mit dem Standardextraktionstest (RdRp/E/RNaseP) getestet (Abb. 4) und innerhalb von 12 Stunden nach Erhalt mit dem HGDirect-PCR-Test getestet. Die prospektiven Tests wurden an 10 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt und führten zur Untersuchung von 908 Salzgurgelproben.

In der zweiten Phase der Validierung wurden nicht anonymisierte Salzgurgelproben prospektiv sowohl mit dem Standard-Extraktions-PCR-Assay als auch mit dem HGDirect-PCR-Workflow getestet. Vor der Berichterstattung wurden Interpretationen und Abweichungsanalysen durchgeführt, wie unten beschrieben.

Es wurde ein Zeitprüfungsprozess durchgeführt, um die gesamte praktische Zeit zu ermitteln, die für die Einrichtung (a.) der Standard-KingFisher-RNA-Reinigung mit manueller Pipettierung und (b.) HGDirect-PCR für 92 Proben und 4 Kontrollen erforderlich ist. Jeder Schritt des Prozesses, einschließlich Anmeldung, Barcode-Druck, Probenaliquotierung und Reagenzienvorbereitung für Extraktion und PCR, wurde individuell zeitlich festgelegt (Abb. 4). Der Zeitauditprozess wurde an drei verschiedenen Tagen von drei verschiedenen medizinischen Labortechnologen unabhängig voneinander durchgeführt. Die für jeden Schritt benötigte Zeit wurde gemittelt und auf die nächste Minute gerundet.

In unserem Labor wurde ein konservativer Interpretationsalgorithmus für klinische Proben implementiert, um die Sicherheit vor Kontaminanten und falsch positiven Ergebnissen zu erhöhen (Abb. 3). Eine Probe galt als positiv („POS“), wenn beide SARS-CoV-2-Gene – S und ORF8 – mit einem CT von ≤ 33 nachgewiesen wurden. Wenn beide viralen Gene nicht nachgewiesen wurden, wurde die Probe als negativ („NEG“) betrachtet. vorausgesetzt, das menschliche RNaseP-Gen war positiv (CT ≤ 50). Einzelne SARS-CoV-2-Target-positive Ergebnisse (S+/ORF8− oder S−/ORF8+) wurden als „unbestimmt“ („IND“) eingestuft, während diejenigen, bei denen keine Ergebnisse für eines der Gen-Targets (S/ORF8+) erfasst wurden, als „unbestimmt“ („IND“) eingestuft wurden /RNaseP) wurden als „Ungültig“ („IVLD“) eingestuft. Wenn aufgrund eines Flüssigkeitsausgabefehlers keine Probe in die RT-qPCR-Assay-Reaktion abgegeben wurde, wurden keine RT-qPCR-Daten aufgezeichnet und diese Proben wurden als „INVLD“ klassifiziert. Die IND/IVLD-Proben und schwach positiven Proben (CT 33–40) wurden klinisch aufgelöst, indem die ursprüngliche Patientenprobe entweder auf dem Xpert Xpress SARS-CoV-2 (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA) oder dem BDMAX SARS-CoV-2 getestet wurde. 2-Test (Becton Dickinson, Quebec City, QC, Kanada). Für die klinische Berichterstattung wurde das kommerzielle Testergebnis akzeptiert. Der Xpert medizinische-geräte/autorisiert/expanded-use.html).

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Diese Studie wurde von British Columbia Provincial Laboratory Medicine Services und durch einen großzügigen Zuschuss des Peter Wall Institute for Advanced Studies (PWIS) der University of British Columbia finanziert. Wir danken der BC Children's Hospital Biobank für die Leihgabe des Hamilton STARlet-Instruments für die COVID-19-Pandemie. Wir möchten uns auch für die Unterstützung unserer erfahrenen Technologen bedanken, insbesondere Alice Liu, Maria Ramos, Abbas Dilawer und Virginia Young.

Abteilung für Pathologie und Labormedizin, Abteilung für Mikrobiologie, Virologie und Infektionskontrolle, BC Children's and Women's Hospital + Sunny Health Center, Vancouver, Kanada

Vijay J. Gadkar, David M. Goldfarb, Ghada N. Al-Rawahi, Jocelyn A. Srigley, Nicole Watson, Tammy Chen, Sunny Lam und Peter AG Tilley

Abteilung für Pathologie und Labormedizin, Medizinische Fakultät, University of British Columbia, Vancouver, Kanada

Vijay J. Gadkar, David M. Goldfarb, Ghada N. Al-Rawahi, Jocelyn A. Srigley, Linda Hoang und Peter AG Tilley

Kanadas Michael Smith Genome Science Centre am BC Cancer, BC Cancer Research Institute, Vancouver, BC, Kanada

Duane E. Smailus, Robin JN Coope und Stephen Pleasance

Public Health Laboratory, British Columbia Centre for Disease Control, Vancouver, Kanada

Linda Hoang

Abteilung für Pathologie und Labormedizin, Abteilung für Mikrobiologie, Virologie und Infektionskontrolle, BC Children's and Women's Hospital, Raum Nr. 2K9, 4500 Oak St, Vancouver, V6H 3N1, Kanada

Vijay J. Gadkar

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VJG: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, formale Analyse, Ressourcen, Projektverwaltung, Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. DMG: Konzeptualisierung, formale Analyse, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. GNR: Formale Analyse, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. JAS: Formale Analyse, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. DS: Entwicklung und Fehlerbehebung der Automatisierung, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten. RC: Konzeptualisierung der Automatisierung, Fehlerbehebung, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. SP: Entwicklung und Fehlerbehebung der Automatisierung, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. NW: Methodik, Validierung. TC: Methodik, Validierung. SL: Datenübertragung und Schnittstelle. LH: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, formale Analyse, Ressourcen, Projektverwaltung, Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. PT: Konzeptualisierungsüberwachung, formale Analyse, Finanzierungsbeschaffung, Projektverwaltung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Vijay J. Gadkar.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Gadkar, VJ, Goldfarb, DM, Al-Rawahi, GN et al. Extraktionsfreier klinischer Nachweis des SARS-CoV-2-Virus aus Salzgurgelproben mit dem Hamilton STARlet Liquid Handler. Sci Rep 13, 4241 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30993-2

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Eingegangen: 12. Mai 2022

Angenommen: 06. März 2023

Veröffentlicht: 14. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30993-2

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