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Mar 22, 2024

Regulierung der Genbearbeitung mithilfe von T

Nature Plants (2023) Diesen Artikel zitieren. Einzelheiten zu den Metriken. Die Transformation über Agrobacterium tumefaciens ist die vorherrschende Methode zur Einführung exogener DNA in Pflanzengenome1,2. Transfer-DNA (T-DNA)

Naturpflanzen (2023)Diesen Artikel zitieren

Details zu den Metriken

Die Transformation über Agrobacterium tumefaciens ist die vorherrschende Methode zur Einführung exogener DNA in Pflanzengenome1,2. Transfer-DNA (T-DNA), die aus Agrobacterium stammt, kann als einzelne Kopie oder in komplex verketteten Formen integriert werden3,4, die Mechanismen, die die endgültige T-DNA-Struktur beeinflussen, sind jedoch noch unbekannt. Hier zeigen wir, dass der Einschluss von Retrotransposon (RT)-abgeleiteten Sequenzen in T-DNA die T-DNA-Kopienzahl in Arabidopsis thaliana um mehr als das 50-fache erhöhen kann. Diese zusätzlichen T-DNA-Kopien sind in großen Concatemeren organisiert, ein Effekt, der hauptsächlich durch die langen terminalen Wiederholungen (LTRs) von RTs hervorgerufen wird, die unter Verwendung von Nicht-LTR-DNA-Wiederholungen repliziert werden können. Wir fanden heraus, dass die T-DNA-Verkettung von der Aktivität der DNA-Reparaturproteine ​​MRE11, RAD17 und ATR abhängt. Schließlich zeigen wir, dass die T-DNA-Verkettung genutzt werden kann, um die Häufigkeit gezielter Mutagenese und Gen-Targeting zu erhöhen. Insgesamt deckt diese Arbeit molekulare Determinanten auf, die die T-DNA-Kopienzahl in Arabidopsis modulieren, und zeigt den Nutzen der Induktion der T-DNA-Verkettung für die Bearbeitung pflanzlicher Gene.

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Die aus dieser Studie generierten Daten sind in den Hauptzahlen, erweiterten Daten und Zusatzinformationen enthalten. Rohe Sequenzierungsdaten werden bei der NCBI SRA (BioProject PRJNA892619) hinterlegt. Bei der Analyse der Daten wurden das TAIR10-Arabidopsis-Genom (https://www.arabidopsis.org/download/index-auto.jsp%3Fdir%3D%252Fdownload_files%252FGenes%252FTAIR10_genome_release) und die Liste „Orthologe Genfamilie“ herangezogen aus der Dicots PLAZA 5.0-Datenbank (https://ftp.psb.ugent.be/pub/plaza/plaza_public_dicots_05/GeneFamilies/genefamily_data.ORTHOFAM.csv.gz). Es gibt keine Einschränkungen hinsichtlich der Datenverfügbarkeit. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Jacob-Labors, insbesondere F. Langhammer und G. Villarino, für Reagenzien, Diskussionen und Ratschläge; C. Bolick und seine Mitarbeiter in Yale für ihre Hilfe beim Pflanzenwachstum und bei der Pflege; H. Puchta vom Karlsruher Institut für Technologie für seine großzügigen Schenkungen des in dieser Arbeit verwendeten Gens, das auf binäre Plasmide abzielt; und Marco Molina und Mayra Molina (Multi-Crop Transformation Facility, Texas A&M University) für die Erzeugung der in dieser Studie verwendeten transgenen Tabakpflanzen. Dieses Projekt wurde durch den Zuschuss R35GM128661 der National Institutes of Health (YJ) und einen NIH Director's New Innovator Award (DP2GM137414 an SW) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lauren Dickinson, Wenxin Yuan.

Abteilung für Molekular-, Zell- und Entwicklungsbiologie, Fakultät für Künste und Naturwissenschaften, Yale University, New Haven, CT, USA

Lauren Dickinson, Wenxin Yuan, Chantal LeBlanc, Geoffrey Thomson und Yannick Jacob

Abteilung für Genetik, Yale School of Medicine, Yale University, New Haven, CT, USA

Siyuan Wang

Abteilung für Zellbiologie, Yale School of Medicine, Yale University, New Haven, CT, USA

Siyuan Wang

Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, Yale University, New Haven, CT, USA

Yannick Jacob

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YJ überwachte die Studie und entwarf die Experimente mit LD und WY. Alle Experimente wurden von LD und WY durchgeführt, mit Ausnahme der gezielten Mutagenesearbeit (durchgeführt von CL) und der bioinformatischen Analysen (durchgeführt von GT). SW hat die Sonden für die FISH-Experimente entworfen. YJ und CL haben den Artikel geschrieben, mit Beiträgen von LD und WY

Korrespondenz mit Yannick Jacob.

Eine Patentanmeldung (Patentanmeldung Nr. 63/481,276, US-Patent- und Markenamt, 24. Januar 2023) mit YJ, LD und WY als Erfindern bezog sich auf die Verwendung repetitiver Sequenzen und genetischer Mutationen zur Regulierung der T-DNA-Kopienzahl und Verbesserung der Genbearbeitung, wurde eingereicht. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Plants dankt Avraham Levy, Damon Lisch und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, DNA-qPCR von ALS in Col-0- (nicht transformierten) und T1-Pflanzen, die für das FISH-Experiment verwendet wurden (Panel b und Abb. 1e). Punkte stellen DNA-Proben aus einzelnen Blättern derselben T1-Pflanze dar (n = 4 für Col-0, ONSEN RT #1 und ONSEN RT #2, n = 3 für No RT). Horizontale Balken geben den Mittelwert an. SD wird angezeigt. b, FISH in Blattkernen, die auf die T-DNA-Sequenz abzielen. Die Kerne wurden mit DAPI und Sonden für ALS (grün) und NPTII (rot) gefärbt. Das FISH-Experiment wurde >3 Mal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

a, DNA-qPCR von ALS in den No RT- und ONSEN RT T1-Pflanzen, die für die Sequenzierung des gesamten Genoms verwendet wurden (Panel b, Abb. 1f, g und Abb. 3b). b, Ortsdiagramme für die identifizierten T-DNA-Insertionen. Die Koordinaten für jede Insertion basieren auf der TAIR10-Annotation und entsprechen den genomischen Grenzen von Arabidopsis, die jede identifizierte T-DNA umgeben. Bei jeder Einfügung stellen die oberen Linien die unveränderte Genomsequenz mit annotierten Genen (Marineblautöne) dar. Rote Pfeile stellen Einfügepunkte dar. Die unteren Zeilen zeigen die Grenzen der Insertion detaillierter, wobei die identifizierte Insertion der binären Vektorsequenz (Nicht-T-DNA-Region) oder der T-DNA-Komponenten gezeigt wird. Gestrichelte Linien stellen zusammenhängende T-DNA-assoziierte Kassetten dar. Rote Balken zeigen die binäre Vektorsequenz (Nicht-T-DNA) an. Dunkelblaue Balken (LB) und hellgraue Balken (pea3A(T)) zeigen das 5′-Ende des T-DNA-Konstrukts an (obwohl es im Pflanzengenom in 5′- oder 3′-Ausrichtung vorliegen kann). Dunklere graue Balken neben den roten Balken sind Füllsequenzen und der blaugrüne Balken stellt die NPTII-Sequenz dar.

a, Schematische Darstellung der sgRNA-Gendeletion aus dem No RT-Vektor. b, DNA-qPCR von ALS in Col-0 (nicht transformiert) und in T1-Pflanzen, transformiert mit dem No RT-Plasmid und dem No RT-Plasmid mit deletiertem sgRNA-Gen. Jeder Punkt stellt eine einzelne Pflanze dar (n = 21 für Col-0, n = 26 einzelne T1-Pflanzen für No RT und No RT, sgRNA-Gendeletionen). Horizontale Balken geben den Median an. PCol-0 = 0,00000002, ns = nicht signifikant unterschiedlich (Kruskal-Wallis ANOVA gefolgt von Dunn-Test). C. Schematische Darstellung der sgRNA-Gendeletion aus dem ONSEN RT-Vektor. D. DNA-qPCR von ALS in Col-0 (nicht transformiert) und in T1-Pflanzen, die mit dem ONSEN RT-Plasmid und dem ONSEN RT-Plasmid transformiert wurden, wobei beide sgRNA-Gene gelöscht wurden. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne Pflanze (n = 22). Horizontale Balken geben den Median an. PCol-0 = 0,00000004, ns = nicht signifikant unterschiedlich (Kruskal-Wallis ANOVA gefolgt von Dunn-Test). e. DNA-qPCR von ALS in Tabakpflanzen, die durch biolistisches Bombardement mit Partikeln transformiert wurden, die mit No RT- oder ONSEN RT-Plasmid-DNA beschichtet waren. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne Pflanze. Horizontale Balken geben den Median an. ns = nicht signifikant unterschiedlich (zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test). ns, P > 0,05; ****, P < 0,0001.

Quelldaten

a, Mehrfachsequenz-Alignments von Übergängen zwischen zwei T-DNA-Sequenzen, gruppiert nach der Orientierung der beiden Sequenzen (RB-LB, LB-LB oder RB-RB). Referenzsequenzen wurden unter der Annahme konstruiert, dass T-DNA-Moleküle unmittelbar stromaufwärts der Endonuklease (VirD2)-Erkennungssequenz (5′-CAGGATATATT-3′) begannen und endeten63,64. Füllsequenzen sind rot und Sequenzen, die mit mikrohomologiebedingten Deletionen übereinstimmen, sind unterstrichen. Wenn Füllsequenzen eine ähnliche Sequenz in der Nähe haben, werden diese (und die benachbarte Sequenz) ebenfalls unterstrichen. Sternchen kennzeichnen identische Kreuzungen, die in unabhängigen Anlagen vorkommen. b, Darstellung von T-DNA-Verbindungen mit einer anderen T-DNA oder binären Vektorsequenz, die intern nicht unmittelbar an den LB oder RB angrenzt. C. Klassifizierung der RB-LB-, LB-LB- und RB-RB-Sequenzen für jede T1-Linie nach einem zuvor beschriebenen Verfahren65. NHEJ (<4 bp-Deletionen und <5 bp-Insertionen), Insertionen (≥5 bp mit jeder Deletion), Nicht-Mikrohomologie (Nicht-MH; ≥4 bp-Deletion oder <5 bp-Insertionen mit Mikrohomologien <2) und Mikrohomologie (MH ; ≥4 bp Deletion mit Mikrohomologien ≥2). Die letzten drei sind mit der DNA-Polymerase Theta verbunden.

a, DNA-qPCR von ALS in Col-0-, atxr5/6- und tsk-Pflanzen, transformiert mit dem ONSEN RT-Konstrukt. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne T1-Pflanze (n = 24). Horizontale Balken geben den Median an. ns = nicht signifikant unterschiedlich (Kruskal-Wallis ANOVA gefolgt von Dunn-Test). b, DNA-qPCR von ALS in DNA, die 16 Tage und 30 Tage nach der Keimung aus Blättern von T1-Pflanzen extrahiert wurde.

Quelldaten

A. Genstruktur von CRY2. Graue Balken stellen Exons dar und blaue Balken stellen Regionen dar, auf die sgRNAs abzielen. b, c. INDEL-Häufigkeit von CRY2-PCR-Produkten, die aus DNA amplifiziert wurden, die aus Blättern einzelner T1-Pflanzen extrahiert wurde, die entweder mit No RT- oder ONSEN RT-Konstrukten transformiert wurden. Konstrukte trugen entweder (b) sgRNA #2 oder (c) sgRNA #3. D. DNA-qPCR von ALS in T1-Pflanzen ohne nachweisbare CRY2-Indels (No indels) oder nachweisbare Indels (Indels) unter Verwendung von CRY2 sgRNA #3. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne T1-Pflanze (n = 20). Horizontale Balken geben den Median an. *P = 0,0350 (zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test) e. DNA-qPCR von ALS in T1-Pflanzen ohne RT und ONSEN RT (grau) im Verhältnis zum Prozentsatz der echten (nicht-ektopischen) Gen-Targeting-Raten in der T2-Generation (rot).

Quelldaten

Das Modell baut auf dem T-DNA-Integrationsmodell von Kralemann et al., 20226 auf. Die chromosomale Erfassung eines T-DNA-Strangs am 3′-Ende wird durch TMEJ vermittelt. Nach der Umwandlung in ein doppelsträngiges T-DNA-Zwischenprodukt wird das Einfangen des 5′-Endes der T-DNA durch Entfernung des Agrobacterium-Proteins VirD2 durch TDP2 oder MRE11 erreicht. Durch die TDP2-vermittelte Entfernung von VirD2 entsteht am 5′-Ende der T-DNA stumpfe DNA, die durch NHEJ an das Chromosom ligiert wird. Im Gegensatz dazu entfernt MRE11 als Teil des MRN-Komplexes (MRE11-RAD50-NBS1; durch RAD1725 auf die DNA geladen) VirD2, indem es die T-DNA intern schneidet, wodurch ein versetztes Ende am 5′-Ende der T-DNA entsteht. Die TDP2/NHEJ-Aktivität führt zu einer einzelnen T-DNA-Kopienintegration (Ergebnis A), während die MRE11/TMEJ-Aktivität zu mehreren Ergebnissen führt (BE), wobei das einfachste die chromosomale Erfassung des 5′-Endes der T-DNA ist (Ergebnis B). . Alternativ kann das versetzte 5′-Ende der T-DNA die Rekrutierung zusätzlicher T-DNA-Stränge für die Ligation erleichtern, was zu einer Verkettung führt. Die Erfassung des 5′-Endes eines zusätzlichen T-DNA-Strangs durch TDP2/NHEJ anstelle von MRE11/TMEJ beendet den Verkettungszyklus mit größerer Wahrscheinlichkeit. In diesem Modell können T-DNA-Merkmale wie DNA-Wiederholungen den Verkettungsgrad erhöhen, indem sie die Anzahl der für die Integration verfügbaren T-DNA-Stränge und/oder ihre Zugänglichkeit erhöhen. ssDNA: einzelsträngige DNA. dsDNA: doppelsträngige DNA. Erstellt mit BioRender.com.

Ergänzende Tabelle 1. Liste der für die FISH-Analyse verwendeten Sonden und Primer.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Dickinson, L., Yuan, W., LeBlanc, C. et al. Regulierung der Genbearbeitung mittels T-DNA-Verkettung. Nat. Pflanzen (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01495-w

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Eingegangen: 31. Oktober 2022

Angenommen: 18. Juli 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01495-w

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