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Oct 21, 2023

ADP reduziert

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 888 (2023) Diesen Artikel zitieren 23 Zugriffe auf Metrikdetails Das CCT/TRiC-Chaperonin kommt im Zytosol aller eukaryotischen Zellen vor und unterstützt Proteine

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 888 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das CCT/TRiC-Chaperonin kommt im Zytosol aller eukaryontischen Zellen vor und unterstützt die Proteinfaltung auf ATP-abhängige Weise. Es ist bekannt, dass die heterozygote Doppelmutation T400P und R516H in der Untereinheit CCT2 die Leber-kongenitale Amaurose (LCA) verursacht, eine erbliche angeborene Retinopathie. Diese Doppelmutation führt auch dazu, dass die Funktion der Untereinheit CCT2, wenn sie sich außerhalb des CCT/TRiC-Komplexes befindet, bei der Förderung der Autophagie fehlerhaft ist. Hier zeigen wir mithilfe einer stationären und transienten kinetischen Analyse, dass die entsprechende Doppelmutation in der Untereinheit CCT2 von Saccharomyces cerevisiae die Off-Rate von ADP während der ATP-Hydrolyse durch CCT/TRiC reduziert. Wir berichten auch, dass die ATPase-Aktivität von CCT/TRiC durch ein nicht gefaltetes Substrat stimuliert wird. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass der geschlossene Zustand von CCT/TRiC durch die Doppelmutation aufgrund der langsameren Off-Rate von ADP stabilisiert wird, wodurch der Austritt von CCT2 aus dem Komplex behindert wird, der für seine Funktion in der Autophagie erforderlich ist.

Die angeborene Leberamaurose (LCA) ist eine erbliche Netzhautdystrophie, die für etwa 20 % der Fälle von Blindheit im Kindesalter verantwortlich ist1,2. LCA wird derzeit mit Mutationen in 38 Genen in Verbindung gebracht. Einige der häufigsten LCA-bedingten Mutationen treten in Genen auf, die ausschließlich oder überwiegend in der Netzhaut oder dem retinalen Pigmentepithel exprimiert werden, wie etwa jene, die für Guanylatcyclase-1, Retinoid-Isomerase, Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase 1 und Retinol-Dehydrogenase 121 kodieren ,2. Interessanterweise wurde jedoch berichtet, dass die heterozygote Doppelmutation T400P und R516H in der Untereinheit CCT2 des ubiquitär exprimierten CCT/TRiC-Chaperonins ebenfalls LCA-verursachend ist3. Das CCT/TRiC-Chaperonin, das im Zytosol aller eukaryotischen Zellen vorkommt, unterstützt die Proteinfaltung auf ATP-abhängige Weise4,5,6,7,8. Es besteht aus zwei hintereinander gestapelten oligomeren Ringen mit jeweils einem Hohlraum, in dem die Proteinfaltung unter Schutzbedingungen stattfinden kann4,5,6,7,8. Jeder CCT/TRiC-Ring besteht aus acht verschiedenen Untereinheiten, CCT1 bis CCT8, die in einer festen Reihenfolge um den Ring herum angeordnet sind. CCT/TRiC wechselt zwischen einem offenen Apo-Zustand, der Klienten über untereinheitsspezifische Kontakte binden kann, und einem geschlossenen Zustand, der nach kooperativer ATP-Bindung und Hydrolyse erreicht wird und in dem der Klient eingekapselt wird4,5,6,7,8.

Es wird angenommen, dass die Faltungsfunktion von CCT/TRiC den intakten oligomeren Komplex erfordert, aber einzelne Untereinheiten könnten auch eine Nebenrolle spielen, wie in frühen Studien9,10 durch die Entdeckung einiger von ihnen im Zellkern nahegelegt wurde. Kürzlich wurde beispielsweise berichtet, dass die Monomeruntereinheit CCT2 mit Mitgliedern der Autophagosomenmarker-ATG8-Familie interagiert und dadurch den autophagischen Abbau fester Proteinaggregate fördert11. Es wurde festgestellt, dass diese Wechselwirkung durch die humanen CCT2-Reste VLL an den Positionen 503–505 und VIL an den Positionen 513–515 vermittelt wird, die bei der Dissoziation der Untereinheit CCT2 vom Rest des CCT/TRiC-Komplexes freigelegt werden. Die Nähe der Stelle der LCA-assoziierten Mutation R516H zu diesen ATG8-interagierenden Resten deutet darauf hin, dass sie Krankheiten verursachen kann, indem sie das Targeting der autophagischen Membran und den Abbau fester Aggregate beeinträchtigt. Über einen Zusammenhang zwischen LCA und beeinträchtigter Autophagie wurde tatsächlich bereits früher berichtet12. Es wurde festgestellt, dass beide Mutationen, R516H und T400P, die Assoziation von CCT2 mit Atg811 verringern, der Mechanismus, durch den dies durch die Mutation T400P verursacht wird, blieb jedoch weniger klar. Da sich die Mutation T400P in Helix 14 befindet, die einen konservierten katalytischen Asparaginrest enthält, wurde spekuliert11, dass T400P die ATPase-Aktivität von CCT/TRiC verändert und seinen geschlossenen Zustand stabilisiert. Die Stabilisierung des geschlossenen Zustands würde die Dissoziation der CCT2-Untereinheit vom Komplex behindern und dadurch die Autophagie beeinträchtigen. Hier haben wir diese Hypothese getestet, indem wir eine detaillierte Analyse der ATPase-Aktivität von CCT/TRiC aus Saccharomyces cerevisiae mit den Mutationen T394P und R510H in der Untereinheit CCT2 durchgeführt haben.

Die Reste T394 und R510 in S. cerevisiae CCT2, die den Resten T400 und R516 in menschlichem CCT2 entsprechen, befinden sich in den Helices 14 bzw. 18 (Abb. 1a). Diese Helices sind, wie der Rest von CCT2, in Menschen, Hefen und anderen Organismen hoch konserviert (Abb. 1b). Der Vergleich der Kryo-EM-Struktur von menschlichem CCT2 und der Kristallstruktur von Hefe-CCT2, beide in einem nukleotidgebundenen Zustand, zeigt, dass sie sehr ähnlich sind (Abb. 1c), wie angesichts der hohen Sequenzidentität zu erwarten war, und legt nahe, dass Auswirkungen von Mutationen in Hefe-CCT2 in Bezug auf die ATPase-Aktivität können denen in menschlichem CCT2 ähneln. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass diese Mutationen die Autophagie bei Hefen beeinträchtigen (ergänzende Abbildung 1), wie bereits zuvor für Menschen berichtet11. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Analyse der Auswirkungen dieser Mutationen in Hefe-CCT/TRiC Aufschluss über ihre Auswirkungen auf den Menschen geben kann.

a Kristallstruktur der Hefe-Untereinheit CCT2 (PDB-ID: 4V8R) im ADP-gebundenen Zustand mit den mutierten Resten (rot), den Helices 14 (cyan) und 18 (gold) und ADP (grün). Die Kontaktstelle zwischen Helix 14 und ADP ist vergrößert. Es zeigt sich, dass eine Mutation an Position 394 über S490 eine allosterische Wirkung auf das mit ADP in Kontakt stehende E489 haben kann. Eine Mutation an Position 510 kann ADP über eine Starrkörperbewegung der Helix 18 beeinflussen. Ebenfalls gezeigt ist D386 (rosa), ein konservierter katalytischer Rest. b Ausrichtung der Sequenzen von Helix 14 (oben) und Helix 18 und Strang 25 (unten) in der Untereinheit CCT2 verschiedener Organismen. Die mutierten Positionen werden in Cyan und andere konservierte Positionen in Gelb hervorgehoben. Die Nummerierung entspricht Hefe CCT2. Die gesamten Aminosäuresequenzidentitäten von Hefe und Mensch betragen Helix 14, Helix 18 und Strang 25 sowie die gesamte CCT2-Untereinheit etwa 78, 71 bzw. 65 %. Die entsprechenden Sequenzähnlichkeiten betragen etwa 87, 92 bzw. 80 %. c Überlagerte Kryo-EM-Struktur von menschlichem CCT2 (PDB-ID: 7LUM) und die Kristallstruktur von Hefe-CCT2 (PDB-ID: 4V8R), beide im geschlossenen Zustand. Die Strukturen sind sehr ähnlich, was durch eine quadratische Abweichung von ~1,2 Å angezeigt wird. Die Panels a und c wurden mit Chimera Version 1.15 erstellt. Es wird der Ein-Buchstaben-Code der Aminosäuren verwendet.

Die Steady-State-ATPase-Aktivitäten von Wildtyp-CCT/TRiC, den T394P- und R510H-Einzelmutanten und der entsprechenden Doppelmutante wurden durch Messung der anfänglichen ATP-Hydrolyseraten als Funktion der ATP-Konzentration charakterisiert (Abb. 2). Die Kurven für den Wildtyp und die beiden Einzelmutanten, die ähnliche Profile aufwiesen, wurden an Gl. angepasst. 1 für zwei allosterische Übergänge. Im Fall des Wildtyps betrugen die Werte der scheinbaren ATP-Bindungskonstanten K1 und K2 8,3 (±1,6) bzw. 110 (±39) μM und die Werte der Hill-Konstanten für den Wildtyp Der erste und der zweite Übergang, n und m, betrugen 1,5 (±0,3) bzw. 3,0 (±1,9). Diese Werte stimmen hervorragend mit den jeweiligen Werten von 9,6 (±0,4) und 97 (±58) μM für K1 und K2 und den jeweiligen Werten von 1,2 (±0,6) und 3,0 (±0,2) für n und m überein berichtet vor13. Die kcat-Werte für die ATP-Hydrolyse durch einen und beide Ringe betrugen 0,043 (±0,005) bzw. 0,053 (±0,001) s−1 und lagen somit nahe an den zuvor berichteten Werten13. Im Fall der R510H-Einzelmutante betrugen die Werte der scheinbaren ATP-Bindungskonstanten K1 und K2 7,1 (±2,4) bzw. 31 (±4) μM und die Werte der Hill-Konstanten für die R510H-Einzelmutante Der erste und der zweite Übergang, n und m, betrugen 2,1 (±0,9) bzw. 5,3 (±4). Die kcat-Werte für die ATP-Hydrolyse durch einen und beide Ringe dieser Mutante betrugen 0,10 (±0,03) bzw. 0,150 (±0,002) s−1. Im Fall der T394P-Einzelmutante betrugen die Werte der scheinbaren ATP-Bindungskonstanten K1 und K2 8,9 (±3,4) bzw. 66 (±24) μM und die Werte der Hill-Konstanten n und m betrugen 1,7 (±0,6) bzw. 3,2 (±2,0). Die kcat-Werte für die ATP-Hydrolyse durch einen und beide Ringe dieser Mutante betrugen 0,11 (±0,03) bzw. 0,150 (±0,003) s−1.

Die Anfangsgeschwindigkeiten der ATP-Hydrolyse durch Wildtyp-CCT/TRiC und die verschiedenen Mutanten wurden bei unterschiedlichen ATP-Konzentrationen unter Verwendung einer endgültigen Oligomerkonzentration von CCT/TRiC von 20 nM gemessen. Die Daten für Wildtyp-CCT/TRiC (a) und die einzelnen Mutanten (b) wurden an Gl. angepasst. 1 für zwei allosterische Übergänge. Weitere Einzelheiten finden Sie unter Materialien und Methoden. Fehlerbalken stellen Standardfehler dar.

Bemerkenswerterweise weist die Kurve für die Doppelmutante jedoch einen kleinen, aber reproduzierbaren Peak bei etwa 150 μM ATP auf, der in den Daten für die Einzelmutanten fehlt (Abb. 2b) und für Wildtyp-CCT/TRiC bisher nicht berichtet wurde. Die Kurve für die Doppelmutante ähnelt jedoch qualitativ den biphasischen Kurven von Wildtyp-GroEL14. Im Fall von GroEL wurde die Abnahme der ATPase-Aktivität bei höheren ATP-Konzentrationen auf die langsame Off-Rate von ADP zurückgeführt und es wurde dementsprechend festgestellt, dass sie in der GroEL-Mutante E257A mit einer schnellen Off-Rate für ADP15 nicht vorhanden war. Die deutliche Kurve der Doppelmutante im Vergleich zu der der Einzelmutanten stimmt mit der Studie von Minegishi et al. überein. 3 zeigt, dass heterozygote Personen mit beiden Mutationen an LCA leiden, während Personen mit einem Wildtyp-Allel und einem mutierten Allel (T400P oder R516H) dies nicht tun (obwohl die Doppelmutante in unserer Arbeit beide Mutationen in beiden Ringen enthält (ergänzende Abbildung 2). )). Angesichts des durch diese Ergebnisse nahegelegten Zusammenhangs zwischen der durch die Doppelmutation verursachten LCA und einer langsamen Off-Rate für ADP haben wir beschlossen, weiter zu testen, ob die Off-Rate für ADP bei der Doppelmutante tatsächlich langsamer ist.

Die ATPase-Aktivitäten von Wildtyp-CCT/TRiC und der Doppelmutante wurden durch transiente kinetische Experimente genauer untersucht. Gleiche Volumina von CCT/TRiC und unterschiedliche Konzentrationen von ATP wurden schnell mit einem Stopped-Flow-Gerät gemischt, und die zeitaufgelösten Änderungen der anorganischen Phosphatkonzentration bei der ATP-Hydrolyse wurden durch Messung der Änderung der Fluoreszenz einer Cumarin-markierten Phosphatbindung verfolgt Protein (PBP)16. Für jede ATP-Konzentration wurden 5–10 Spuren (jeweils mit 2000 Datenpunkten) gemittelt und an Gl. angepasst. S14 in der Ergänzenden Anmerkung 1. Die durchschnittlichen Spuren von Wildtyp-CCT/TRiC und der Doppelmutante bestehen alle, wie zuvor beobachtet17, aus zwei Burst-Phasen, gefolgt von einer Verzögerungsphase und dann einer Steady-State-Phase, die jeweils durch drei beschrieben werden exponentielle Terme und ein linearer Term in Gl. S14.

Diagramme der Raten und Amplituden der beiden Burst-Phasen für Wildtyp-CCT/TRiC und den Doppelmutanten sind in Abb. 3 dargestellt. Drei Beweislinien deuten darauf hin, dass die Off-Rate von ADP des Doppelmutanten langsamer ist als die von der Wildtyp. Zunächst ist zu erkennen, dass die Amplituden der Burst-Phasen der Doppelmutante größer sind als die des Wildtyps (Abb. 3b). Im Falle einer schnellen ADP-Freisetzung wird sich die erste Runde der ATP-Hydrolyse, die keine vorherige ADP-Freisetzung beinhaltet, kaum von den nachfolgenden Runden unterscheiden, die eine ADP-Freisetzung erfordern, was zu Burst-Phasen mit verringerten Amplituden führt. Zweitens ist zu erkennen, dass die Geschwindigkeit der Burst-Phasen der Doppelmutante mit steigenden ATP-Konzentrationen hyperbolisch zunimmt, während die des Wildtyps abnimmt (Abb. 3a). Diese zunehmenden und abnehmenden Abhängigkeiten von den Ligandenkonzentrationen (ATP) stehen im Einklang mit einfachen Bindungs- (oder induzierten Anpassungs-) bzw. Konformationsselektionsmechanismen der Ligandenbindung18, wie zuvor17 für Wildtyp-CCT/TRiC berichtet und für die Doppelmutante in Abb. gezeigt. 4. Die scheinbare Ligandenaffinität im Fall der einfachen Bindung (oder induzierten Anpassung) ist höher als bei der Konformationsselektion18, was darauf hindeutet, dass die Off-Rate von ADP des Doppelmutanten niedriger ist als die des Wildtyps. Drittens die Anpassung der Daten in Abb. 3a für die Doppelmutante und den Wildtyp an Ausdrücke für die beobachteten Geschwindigkeitskonstanten (siehe Lit. 18 und Legende zu Abb. 3) in Fällen einfacher Bindung bzw. Konformationsselektion. Geben Sie Schätzungen der Ligandenaffinitäten an. Im Fall des Doppelmutanten sind die ATP-Affinitäten, die den beiden Burst-Phasen entsprechen, ähnlich und betragen etwa 7 μM, wohingegen sie im Fall des Wildtyps niedriger sind (etwa 27 und 250 μM), was wiederum darauf hinweist die Off-Rate von ADP des Doppelmutanten ist geringer als die des Wildtyps. Hier haben wir angenommen, dass ein Anstieg der Affinität für ATP auf einen Anstieg auch der Affinität von ADP hinweist, wie er beispielsweise häufig als Reaktion auf die Kaliumkonzentration beobachtet wird19.

Werte der beobachteten Geschwindigkeitskonstanten (a) und Amplituden (b) für die beiden Burst-Phasen (mit 1 und 2 bezeichnet) wurden durch Anpassen der gemittelten Kurven an Gleichung (1) erhalten. S14. Die Daten in (a) für jede der beobachteten Geschwindigkeitskonstanten des Doppelmutanten wurden gemäß einem einfachen Bindungsmechanismus an kobs = kcat[ATP]m/([ATP]m + Kd) angepasst, wobei m und Kd sind die Hill- und ATP-Dissoziationskonstanten. Die Daten in (a) für jede der beobachteten Geschwindigkeitskonstanten des Wildtyps wurden wie zuvor17 gemäß dem Konformationsselektionsmechanismus an kobs = k-1Kd/([ATP]m + Kd) + k1 angepasst, wobei k1 und k-1 sind die Vorwärts- und Rückwärtsgeschwindigkeitskonstanten für die Konformationsänderung. Fehlerbalken stellen Standardfehler dar.

Ta und Tb bezeichnen unterschiedliche Untergruppen von Untereinheiten im T-Zustand. Der Einfachheit halber wird angenommen, dass Ta, Tb und R m, n bzw. q ATP-Moleküle binden, die dann einer Hydrolyse unterliegen. Die beiden Burst-Phasen spiegeln die ATP-Hydrolyse durch die Ta- bzw. Tb-Zustände wider.

Die ATPase-Aktivität von GroEL wird durch nicht gefaltete Substrate wie reduziertes und kalziumarmes α-Lactalbumin20 stimuliert, ein ähnlicher Effekt wurde jedoch für CCT/TRiC bei keinem Substrat berichtet. Angesichts der Tatsache, dass die Stimulierung der ATPase-Aktivität von GroEL durch Substrate auf einen Anstieg der ADP-Off-Rate15 zurückzuführen zu sein scheint, schlussfolgerten wir, dass die ATPase-Aktivität der CCT/TRiC-Doppelmutante möglicherweise stärker stimuliert wird als die des Wildtyps, da dies der Fall ist eine niedrigere ADP-Off-Rate. Die Steady-State-ATPase-Aktivitäten des Wildtyp-CCT/TRiC und der Doppelmutante wurden daher als Funktion der α-Lactalbumin-Konzentration bei einer festen ATP-Konzentration von 300 μM gemessen (Abb. 5). Die Ergebnisse zeigen, dass die ATPase-Aktivität von CCT/TRiC wie im Fall von GroEL20 durch ein nicht gefaltetes Proteinsubstrat stimuliert wird und dass dieser Effekt im Fall der Doppelmutante tatsächlich größer ist, was einen weiteren Beweis dafür liefert, dass sein ADP-Off- Geschwindigkeit ist langsamer. Experimente mit dynamischer Lichtstreuung zeigen, dass die Bindung von α-Lactalbumin an Wildtyp-CCT/TRiC und die Doppelmutante nicht zu deren Destabilisierung führt (ergänzende Abbildung 3).

Die Anfangsgeschwindigkeiten der ATP-Hydrolyse durch das markierte Wildtyp-CCT/TRiC und die Doppelmutante wurden als Funktion der α-Lactalbumin-Konzentration bei einer festen ATP-Konzentration von 300 μM gemessen. Die endgültige Oligomerkonzentration von CCT/TRiC betrug 20 nM. Die Daten für jede Variante wurden anhand ihrer ATPase-Aktivität im Steady-State in Abwesenheit von α-Lactalbumin normalisiert. Weitere Einzelheiten finden Sie unter Materialien und Methoden. Fehlerbalken stellen Standardfehler dar.

Zusammenfassend deuten die hier berichteten Steady-State- und transienten kinetischen Daten darauf hin, dass die Off-Rate von ADP von CCT/TRiC, das T394P/R510H in der Untereinheit CCT2 enthält (was der LCA-verursachenden Doppelmutation beim Menschen entspricht), langsamer ist als die von Wildtyp-CCT/TRiC, was zur Stabilisierung des geschlossenen Zustands der CCT/TRiC-Doppelmutante führt. Die vergrabene Oberfläche von CCT2 im geschlossenen CCT/TRiC-Zustand (PDB-ID: 4V8R) beträgt rechnerisch21 etwa 3600 Å2 mehr als im offenen Zustand (PDB-ID: 5GW4), was etwa 6 kcal mol−1 mehr Bindung entspricht Energie22 im geschlossenen vs. offenen Zustand. Kontaktkarten zeigen, dass CCT2 im geschlossenen bzw. offenen Zustand auch viel mehr Wechselwirkungen zwischen Untereinheiten aufweist (ergänzende Abbildung 4). Ein langlebigerer geschlossener Zustand aufgrund einer langsameren ADP-Off-Rate würde daher den Austritt der Untereinheit CCT2 aus dem Komplex behindern und ihre Funktion außerhalb des Komplexes bei der Autophagie beeinträchtigen11. Es kann geschätzt werden, dass eine zweifach langsamere ADP-Off-Rate, wie durch die Wirkung von α-Lactalbumin auf die ATPase-Aktivität angezeigt (Abb. 5), die Menge an freiem CCT2 um den Faktor zwei verringert (Gleichung S15 in der Ergänzenden Anmerkung). 1). Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass der geschlossene Zustand nach der ATP-Hydrolyse (wie in unseren Experimenten) und nicht nach der Zugabe von ADP erreicht wird.

Aus der vorherigen Arbeit3 ging nicht klar hervor, ob Heterozygoten an LCA leiden, weil alle ihre CCT2-Untereinheiten eine der beiden Mutationen enthalten oder weil ein Anteil (z. B. 50 %) ihrer CCT/TRiC-Komplexe beide Mutationen enthält (ergänzende Abbildung 2). Angesichts der Tatsache, dass die Einzelmutanten in unserer Studie keine veränderten ADP-Off-Raten aufweisen und nur Heterozygoten an LCA leiden, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die veränderte Off-Rate in der Doppelmutante, die vermutlich LCA-verursachend ist, auf die Kommunikation zwischen Ringen zurückzuführen ist zwischen den verschiedenen Mutationen. Eine solche Kommunikation wird wahrscheinlich durch die direkte Interaktion der Untereinheit CCT2 in den beiden Ringen erleichtert, der ihr zugrunde liegende Mechanismus muss jedoch noch geklärt werden. LCA, das durch diese Doppelmutation in CCT2 verursacht wird, könnte daher ein Beispiel sowohl für eine angeborene Störung der Autophagie23 als auch für eine allosterische Erkrankung sein. Bei Zebrafischen wurde auch festgestellt, dass eine andere Störung der Helix 14 in CCT2 (L394H und Deletion der Reste an den Positionen 395–401) die Augenentwicklung beeinflusst24. Es muss noch geklärt werden, ob der Effekt beim Zebrafisch, der auf Zellzyklusdefekte und Zelltod zurückgeführt wurde, auch eine beeinträchtigte Autophagie und Allosterie zwischen den Ringen mit sich bringt.

Die Mutagenese wurde durch RF-Klonierung25 unter Verwendung des pET17b-Plasmids durchgeführt, das das für die S. cerevisiae-Untereinheit CCT2 kodierende Gen enthielt, gefolgt von der Kanamycin-Resistenzkassette und der 3′-untranslatierten Region (UTR) des Gens. Die folgenden mutagenen Vorwärtsprimer wurden verwendet:

T394P: 5'-CGTGTTGTCACAGCCAACAAAGGAAACAAG-3'

R510H: 5'-GCTGAAGTTCTACTACATGTGGATAACATCATCC-3'

zusammen mit den jeweiligen Reverse-Primern: 5'-GTAGAACTTCAGCGGCTTC-3' und 5'-GGATGTGATGTGAGAACTGTATCC-3', um Megaprimer zur Amplifikation der gesamten Plasmide mit den gewünschten Mutationen zu erzeugen. Der Megaprimer zur Erstellung des Plasmids mit der Doppelmutante wurde unter Verwendung des mutagenen Vorwärtsprimers für T394P und des Rückwärtsprimers für R510H generiert. Die Plasmide wurden dann mit XbaI und NotI-HF verdaut, um lineare Fragmente zu erzeugen, die das CCT2-Gen mit der doppelten oder einer der einzelnen Mutationen enthalten. Die Mutationen wurden durch homologe Rekombination in das chromosomale Gen für die Untereinheit CCT2 eingeführt, indem haploide S. cerevisiae-Hefezellen (Stamm BJ2168) mit diesen Fragmenten transformiert wurden. In diesen Zellen wurde das chromosomale CCT6-Gen durch eine Kopie ersetzt, die eine In-Frame-Insertion der kodierenden Sequenz für das Calmodulin-Bindungspeptid (CBP) enthielt, gefolgt von einem selektierbaren Marker (URA3) stromabwärts des Gens26. Der Genotyp dieses Stammes ist Mat a leu2, trp1, gal2, ura3-52, leu2-3, prb1-1122, pep4-3, prc467, CCT6∷CBP∷URA3. Kolonien, die die gewünschten Mutationen enthielten, wurden durch Sequenzierung des gesamten Gens für CCT2 identifiziert. Es wurde festgestellt, dass die Mutationen unter normalen Bedingungen relativ geringe Auswirkungen auf das Zellwachstum haben (ergänzende Abbildung 5).

Zellen, die Wildtyp-CCT/TRiC oder die Mutanten enthielten, wurden in 10 l YPD-Medium mit 300 μg/ml Geneticin bei 30 °C gezüchtet. CCT/TRiC wurde dann im Wesentlichen wie zuvor beschrieben17 gereinigt. Kurz gesagt, Zellpellets wurden in 300 mM Hepes-Puffer (pH 8,0) resuspendiert, der 200 mM NaCl, 35 % Glycerin, 2 mM EDTA und 4 mM DTT enthielt. Die Zellen wurden dann in Gegenwart von 0,01 mg/ml Chymostatin, 0,01 mg/ml Antipain, 0,01 mg/ml Pepstatin A, 0,02 mg/ml Leupeptin und einem 1:500 verdünnten Proteaseinhibitor-Cocktail (Apex Bio, K1007) lysiert. Das Zelllysat wurde 30 Minuten lang bei 17.600 g zentrifugiert. Der Überstand wurde dann durch ein Whatman-Filterpapier geleitet und mit 5 mM CaCl2, 0,01 % LDAO und Aprotininlösung (Sigma A6279) in einer Verdünnung von 1:500 und weiteren 2 mM DTT ergänzt. Das Filtrat wurde dann über Nacht bei 4 °C mit Calmodulin-Kügelchen (GE Healthcare Calmodulin Sepharose 4B) inkubiert, die mit 20 mM Hepes-Puffer (pH 8,0) äquilibriert worden waren, der 1 M NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM DTT, 0,01 % LDAO enthielt 20 % Glycerin (EQ-Puffer). Die Perlen wurden dann in eine Säule gepackt und der Durchfluss verworfen. Die Säule wurde dann mit 70 ml EQ-Puffer, 70 ml Waschpuffer (identisch mit EQ-Puffer, aber mit 0,2 mM CaCl2 und 200 mM NaCl), der 5 mM ATP und 20 mM MgCl2 enthielt, und dann 130 ml Waschpuffer (ohne ATP und MgCl2) gewaschen ) zur Entfernung des ATP. Es wurde darauf geachtet, dass die Flussrate während des Waschens 0,2 ml/min nicht überschritt. Die Elution erfolgte mit einem Waschpuffer, der 10 mM EDTA (ohne CaCl2) enthielt. Alle das Protein enthaltenden Fraktionen wurden auf einen Saccharosegradienten geladen und 64–68 Stunden lang bei 112.700 g zentrifugiert. Die Fraktionen aus dem Gradienten, die CCT/TRiC enthalten, wurden gepoolt, auf 500 μl konzentriert und auf eine Gelfiltrationssäule (GE Healthcare Superose 6 10/300 GL) geladen. Fraktionen, die reines Protein enthielten, wurden kombiniert und auf einer PD10-Säule (GE Healthcare) gegen Tris-Puffer (pH 7,5) mit 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT und 20 % Glycerin gepuffert. Anschließend wurde das Protein konzentriert, in Aliquots aufgeteilt, schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei −80 °C gelagert.

Die anfänglichen (stationären) Geschwindigkeiten der ATP-Hydrolyse wurden wie beschrieben16 gemessen, indem zeitaufgelöste Änderungen der Fluoreszenzemission bei 475 nm von Cumarin-markiertem Phosphat-bindendem Protein (PBP) bei Anregung bei 430 nm mit einem ISS-PCI-Fluorimeter überwacht wurden. PBP wurde exprimiert, indem E. coli BL21-Zellen, die das pET22b-Plasmid enthalten, das das Gen für PBP enthält, wachsen gelassen wurden, bis eine OD von 0,8 erreicht wurde, und dann 0,5 mM IPTG hinzugefügt wurden. Die Zellen wurden dann über Nacht gezüchtet, durch 15-minütiges Zentrieren bei 11.920 g geerntet und dann in 30 ml Puffer mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 U DNase1, Lysozym (100 µg/ml), 1 resuspendiert: 100 Protease-Cocktail-Inhibitor (Apex Bio, K1007), 2 mM MgCl2 und 2 mM DTT. Die resuspendierten Zellen wurden lysiert, indem sie bei 1500 atm durch eine French Press geleitet wurden. Zelltrümmer wurden dann durch 30-minütiges Zentrieren der lysierten Zellen bei 38.720 g entfernt und der Überstand mit Resuspensionspuffer auf ein Endvolumen von 100 ml verdünnt. Der verdünnte Überstand wurde dann auf eine HiTrap Q HP-Säule geladen, die mit einem Resuspensionspuffer äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit 50 ml Resuspensionspuffer wurde das Protein mit einem kontinuierlichen Gradienten von 0–200 mM NaCl im gleichen Puffer unter Verwendung eines Gesamtelutionsvolumens von 250 ml eluiert. Proteinhaltige Fraktionen wurden gesammelt und mittels SDS-PAGE auf Reinheit analysiert. PBP-haltige Fraktionen wurden gepoolt, konzentriert und zur späteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Die Markierung von PBP wurde wie zuvor erreicht16. In Experimenten mit PBP verwendete Nukleotidlösungen wurden wie beschrieben mit Phosphatmop (500 μM 7-Methylguanosin, 1 U PNPase) behandelt16 und die PNPase wurde dann durch Filtern der Nukleotidlösung auf einem Centricon YM-50-Konzentrator entfernt. Die Reaktionen wurden bei 25 °C in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) durchgeführt, der 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 20 % (v/v) Glycerin und 1 mM DTT enthielt. Die Konzentration von CCT/TRiC betrug 20 nM. Änderungen der Fluoreszenz wurden mithilfe von Kalibrierungskurven, die durch Messung der Fluoreszenz von markiertem PBP bei verschiedenen Phosphatkonzentrationen erstellt wurden, in Änderungen der Phosphatkonzentration umgewandelt. Die Daten wurden für zwei allosterische Übergänge an die folgende Gleichung27 angepasst:

Dabei ist [S] die Substratkonzentration (ATP), Vmax(1) und Vmax(2) die jeweiligen maximalen Anfangsraten der ATP-Hydrolyse durch einen einzelnen Ring und durch beide CCT-Ringe, n und m die Hill-Koeffizienten für die ATP-Bindung an den ersten bzw. zweiten Ring, und K1 und K2 sind die jeweiligen scheinbaren Bindungskonstanten von ATP für den ersten bzw. zweiten Ring.

Das in den Steady-State- und transienten kinetischen ATPase-Assays verwendete α-Lactalbumin wurde im Wesentlichen wie zuvor beschrieben hergestellt19. Kurz gesagt, säuredenaturiertes bovines α-Lactalbumin wurde hergestellt, indem 1,75 mg des Proteins in 2,5 ml 0,01 M HCl gelöst und 30 Minuten lang inkubiert wurden. Anschließend wurden Calciumionen entfernt, indem das denaturierte Protein durch eine Sephadex G-25 PD-10-Säule geleitet wurde, die mit 0,01 M HCl voräquilibriert worden war. Das Ca++-abgereicherte Protein wurde dann durch eine weitere G-25 PD-10-Säule geleitet, die mit ATPase-Reaktionspuffer, der 1 mM DTT enthielt, äquilibriert worden war. Die Endkonzentration an ungefaltetem α-Lactalbumin wurde wie beschrieben28 bestimmt.

Die Reaktionen wurden durch Mischen gleicher Volumina von CCT/TRiC (35 nM Oligomer) und PBP (8 μM) mit unterschiedlichen Konzentrationen von ATP (oder verschiedenen Konzentrationen von α-Lactalbumin bei festen Endkonzentrationen von 20 oder 180 μM ATP) unter Verwendung eines Applied Photophysics initiiert SX.17MV Stopped-Flow-Maschine. Die Reaktionen wurden in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT und 20 % Glycerin enthielt, in HPLC-Wasser (phosphatfrei) bei 25 °C durchgeführt. Auf die Phosphatfreisetzung bei der ATP-Hydrolyse folgte eine Anregung bei 430 nm und die Messung der Fluoreszenz des Cumarin-markierten PBP bei Wellenlängen über 455 nm (unter Verwendung eines Cutoff-Filters). Es wurde eine Weglänge von 0,2 cm verwendet und der Wellenlängenbandpass des Eingangsmonochromators auf 9 nm eingestellt. Wir haben für jede ATP-Konzentration einen Durchschnitt von 5–10 Spuren ermittelt (unter Verwendung einer geteilten Zeitbasis mit 1000 Datenpunkten in der ersten Sekunde und 1000 Datenpunkten in der verbleibenden Zeit). Die gemittelten Kurven wurden an Gl. angepasst. S14 (Ergänzende Anmerkung 1) unter Verwendung von Origin. Änderungen der Fluoreszenz wurden mithilfe von Kalibrierungskurven, die durch Messung der Fluoreszenz von markiertem PBP bei verschiedenen Phosphatkonzentrationen erstellt wurden, in Änderungen der Phosphatkonzentration umgewandelt. Es wurde festgestellt, dass die Steigung der Kalibrierungskurve vom genauen Wert der Photomultiplierspannung abhängt. Daher haben wir die Abhängigkeit des Werts der Steigung der Kalibrierungskurve von der Photomultiplierspannung wie beschrieben17 bestimmt, damit die Daten aus jedem Experiment entsprechend umgewandelt werden konnten.

Für DLS-Messungen wurde das Wyatt DynaPro Nanostar II-Instrument verwendet. Dieses Instrument nutzt Lichtstreuung bei 658 nm und einem Streuwinkel von 90°. Für jede Messung wurden 20 μl Proteinproben in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT und 20 % Glycerin enthielt, in eine kleine Einwegküvette geladen. Die Messungen wurden bei 20 °C durchgeführt.

Zellen, die Wildtyp-CCT/TRiC oder CCT/TRiC mit der Doppelmutation T394P/R510H in der Untereinheit CCT2 enthielten, wurden mit dem Plasmid pRS315-CUP9-RNQ1-YFP transformiert, das die Expression von RNQ1-YFP unter der Kontrolle des CUP9-Promotors steuert29 . Einzelne Kolonien wurden gepflückt und 24 Stunden lang in synthetischem definiertem (SD)-Leu-Medium mit 0,5 mM CuSO4 gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert und in SD-Leu-Medium mit oder ohne 0,4 μg/ml Rapamycin resuspendiert. Die Zellen wurden dann 4 Stunden lang gezüchtet und mit einem Olympus IX83-Mikroskop abgebildet, das an einen konfokalen Yokogawa CSU-W1-Spinning-Disk-Scanner mit Dual-Prime-BSI-sCMOS-Kameras 18 (Photometrix) gekoppelt war. Die 16-Bit-Bilder wurden mit zwei Beleuchtungsschemata mit jeweils 30 ms Belichtungszeit aufgenommen: eines für Hellfeld und eines für grüne Fluoreszenz (YFP). Für grüne Fluoreszenz haben wir die Probe mit einem 488-nm-Laser (kohärent 150 mW) angeregt und Licht durch einen Bandpass-Emissionsfilter (525/50 nm, Chroma ET/m) gesammelt. Die Bildgebung wurde mit einem Ölimmersionsobjektiv mit numerischer Apertur ×60/1,42 (UPLSAPO60XO, Olympus) durchgeführt. Nach der Erfassung wurden die Zellen identifiziert und segmentiert und ihr Fluoreszenzsignal wurde mithilfe zuvor gemeldeter Skripte in ImageJ30 identifiziert. Montagen von Zellen wurden mithilfe von Skripten erstellt, über die zuvor berichtet wurde31. Die Materialmenge in Vakuolen wurde mit ImageJ32 berechnet, indem Vakuolenbereiche ausgewählt und die Signalintensität in einem zufälligen Satz von Zellen aus den erhaltenen Fluoreszenzbildern quantifiziert wurden.

Im Fall der Stopped-Flow-Experimente wurden für jede Versuchsbedingung 5–10 Spuren gemittelt und die Daten an Gl. angepasst. S14. Es wurden gute Anpassungen erzielt, was durch zufällige Abweichungen der Residuen um Null angezeigt wurde. Bei den Steady-State-ATPase-Assays wurden alle Experimente mindestens doppelt durchgeführt. Die Fehlerbalken stellen die Standardfehler der Steigungen dar, die sich aus Anpassungen an eine lineare Gleichung ergeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten, die die Schlussfolgerungen dieser Arbeit stützen, sind im veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Die Quellen sind bei Figshare verfügbar: https://figshare.com/s/b859a263cad277b3a7dc.

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Wir danken Prof. Douglas Cyr für die freundliche Spende des pRS315-CUP9-RNQ1-YFP-Plasmids und Prof. Zvulun Elazar für hilfreiche Ratschläge. Diese Arbeit wurde von der Minerva-Stiftung mit Mitteln des Bundesministeriums für Bildung und Forschung gefördert. AIA erhielt Fördermittel aus dem Zuschuss Nr. 075-15-2021-1071 für die Entwicklung genomischer Bearbeitungstechnologien für Innovationen in der industriellen Biotechnologie vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation. AH ist dankbar für die Unterstützung durch das Helen & Milton A. Kimmelman Center for Biomolecular Structure and Assembly und das Ilse Katz Institute for Material Sciences and Magnetic Resonance Research. AH ist Inhaber des Carl und Dorothy Bennett Lehrstuhls für Biochemie.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Mousam Roy, Rachel C. Fleisher.

Abteilung für chemische und strukturelle Biologie, Weizmann Institute of Science, Rehovot, 7610001, Israel

Mousam Roy, Rachel C. Fleisher, Alexander I. Alexandrov und Amnon Horovitz

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AH konzipierte das Projekt und schrieb den ersten Entwurf. MR und RCF führten alle Experimente durch. AIA war an den bildgebenden Experimenten und der Analyse der Hefezellen beteiligt. MR, RCF, AIA und AH haben das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Amnon Horovitz.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Koyeli Mapa und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Elah Pick und Anam Akhtar. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Roy, M., Fleisher, RC, Alexandrov, AI et al. Reduzierte ADP-Off-Rate durch die Hefe-CCT2-Doppelmutation T394P/R510H, die beim Menschen eine Leber-kongenitale Amaurose verursacht. Commun Biol 6, 888 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05261-8

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Eingegangen: 02. April 2023

Angenommen: 20. August 2023

Veröffentlicht: 29. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05261-8

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