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Apr 15, 2024

Identifizierung des neuen potenziellen Erregers Trueperella pecoris mit Interspezies-Bedeutung durch LAMP-Diagnostik

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14005 (2023) Diesen Artikel zitieren 2197 Zugriffe 2 Altmetric Metrics Details Trueperella pecoris wurde als neue Art der Gattung Trueperella beschrieben

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14005 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Trueperella pecoris wurde 2021 als neue Art der Gattung Trueperella beschrieben und könnte für verschiedene Tierarten pathogen sein. Allerdings steht epidemiologischen Erhebungen zur Klärung möglicher Kausalitäten das Fehlen eines geeigneten diagnostischen Testsystems entgegen. In dieser Studie wurde ein LAMP-Assay (Loop-mediated Isothermal Amplification) entwickelt und validiert, der für T. pecoris hochspezifisch war. Der Assay lieferte eine analytische Sensitivität von 0,5 pg/25 µL und zeigte 100 % Inklusivität und Exklusivität für 11 Ziel- bzw. 33 Nicht-Zielstämme. Drei verschiedene DNA-Extraktionsmethoden wurden evaluiert, um die LAMP-kompatibleste Methode für den Zellaufschluss in reinen und komplexen Proben auszuwählen. Unter Verwendung einer vor Ort anwendbaren Einzelpuffer-DNA-Extraktion mit zusätzlicher Erwärmung lag die zellbasierte Nachweisgrenze bei 2,3 KBE/Reaktion. Abschließend wurde der LAMP-Assay anhand künstlich kontaminierter Schweinelungengewebeproben validiert, in denen minimale mikrobielle Belastungen zwischen 6,54 und 8,37 × 103 KBE pro Abstrichprobe nachweisbar waren. Der in dieser Studie etablierte LAMP-Assay stellt ein geeignetes diagnostisches Verfahren zur Identifizierung von T. pecoris in klinischen Proben dar und wird dazu beitragen, epidemiologische Daten zur Pathogenität dieser Art zu sammeln.

Im Jahr 2021 wurde Trueperella (T.) pecoris von Schönecker et al.1 als neue Art der Gattung Trueperella eingeführt. Stämme wurden aus Proben von Milchkühen isoliert, die an Mastitis oder Fehlgeburten litten, und von einem toten Schwein, das bei der Autopsie fibrinöse Pleuritis und eitrige Bronchopneumonie aufwies. Neben diesem Bakterium wurden auch andere potenzielle Krankheitserreger koisoliert, so dass ein ätiologischer Zusammenhang nicht nachgewiesen, aber auch nicht ausgeschlossen werden konnte. Aufgrund der anamnestischen Erhebungen und der Ergebnisse kultureller Untersuchungen vermuteten die Autoren zumindest eine wahrscheinliche Beteiligung von T. pecoris an der Pathogenese der in dieser Studie beschriebenen Mastitisfälle1. Allerdings wurden auch andere Arten der Gattung Trueperella, wie T. abortisuis und T. pyogenes, mit pathologischen Manifestationen bei Schweinen in Verbindung gebracht, darunter Fehlgeburten oder Entzündungen mehrerer Organe2,3. Kürzlich wurde ein weiterer T. pecoris-Stamm aus der nekrotischen Vestibulitis eines Kamels isoliert4.

Abgesehen von den zuvor beschriebenen Ursprüngen der Bakterienisolate und ihren phänotypischen und genotypischen Eigenschaften liegen keine Informationen zu dieser neuen Trueperella-Art vor. Seine Verbreitung und pathogene Bedeutung bleiben unklar, insbesondere weil praktikable, spezifische und zuverlässige Nachweismethoden fehlen. Die von Schönecker et al.1 beschriebene kulturelle Untersuchung mit anschließender biochemischer Differenzierung und Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens bietet möglicherweise bereits Möglichkeiten zur Identifizierung von T. pecoris, ist jedoch sehr arbeitsintensiv und zeitaufwändig. Um die Epidemiologie dieses potenziellen Krankheitserregers effizient untersuchen zu können, sind schnelle Diagnosemethoden erforderlich, die für das Screening einer großen Anzahl heterogener Proben geeignet sind.

Da detaillierte Sequenzinformationen zu verschiedenen T. pecoris-Stämmen verfügbar sind1, sollte die Entwicklung molekularer Nachweismethoden, beispielsweise auf Basis der Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP), in Betracht gezogen werden. Diese Technik wurde im Jahr 20005 eingeführt und hat seitdem in der wissenschaftlichen Gemeinschaft große Aufmerksamkeit erregt. Im Vergleich zu alternativen Methoden wie der PCR ermöglicht LAMP eine schnelle und kontinuierliche Amplifikation bei konstanter Temperatur, sodass kein teures und nicht tragbares Thermocyclinggerät erforderlich ist6. Darüber hinaus erwies sich die Methode als äußerst spezifisch und empfindlich beim Nachweis genomischer Ziele und war gleichzeitig robust gegenüber hemmenden Komponenten in verschiedenen Proben7, 8. Reaktionen können kostengünstig durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung eines Heizblocks9. Für den anschließenden Nachweis von LAMP-Produkten stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, die häufig auf einem sichtbaren Farbumschlag oder einer erzeugten Trübung10 basieren. Neben kostengünstigen Optionen zur Durchführung dieser Methode, die in begrenzten Laborumgebungen von großem Nutzen sein können, sind auch tragbare Echtzeit-Fluorometer oder Trübungsmessgeräte auf dem Markt erhältlich11,12. Diese bieten zusätzliche Funktionen wie die Echtzeitüberwachung der LAMP-Reaktion oder die Erstellung einer Schmelzkurve zur Bewertung der Spezifität eines LAMP-Produkts.

Die vorteilhaften Eigenschaften der LAMP-Methode haben zur Entwicklung mehrerer Tests geführt, die als Point-of-Care-Diagnoseinstrumente für ein breites Spektrum von Krankheitserregern dienen13. Für den Nachweis von Mikroorganismen ist LAMP nahezu universell einsetzbar, sofern eine spezifische genomische Zielregion verfügbar ist. Daher zielte die vorliegende Studie darauf ab, einen einfach durchzuführenden LAMP-Assay zum Nachweis von T. pecoris in klinischen Proben zu entwickeln und zu validieren. In erster Linie soll es ein diagnostisches Werkzeug für die weitere Erforschung epidemiologischer Aspekte und der pathogenen Bedeutung dieser neuen Art darstellen. Darüber hinaus sollte der Test die Anforderungen für einen möglichen späteren Einsatz in der Patientendiagnostik erfüllen.

Eine spezifische und konservierte genomische Zielregion innerhalb des Stamms T. pecoris 19OD0592 (Acc.-Nr. NZ_CP063212.1) wurde von 31.777 bis 31.996 bp unter Verwendung des BLAST-Algorithmus vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) bestimmt (https://blast. ncbi.nlm.nih.gov). Primersequenzen und -positionen sind in Abb. 1 dargestellt. Für die Einrichtung des Trueperella pecoris (TP) LAMP-Assays wurden Primerkonzentrationen und Reaktionstemperatur optimiert. Der konzentrierte TP-Primersatz führte zu einer effektiveren Amplifikation und ergab einen Vorteil von etwa 5 Minuten bei der Nachweiszeit im Vergleich zum Standard-TP-Primersatz (Daten nicht gezeigt). Mit dem konzentrierten Primer-Set wurden die kürzesten Detektionszeiten bei 65 °C gemessen (Abb. 2). Daher wurden der konzentrierte Primersatz und die Reaktionstemperatur von 65 °C als endgültige Laufparameter ausgewählt. Die Positivkontrolle hatte eine mittlere Nachweiszeit von 9,26 ± 0,03 Minuten bei einer Schmelztemperatur des LAMP-Produkts von 90,7 ± 0,06 °C. In den folgenden Experimenten wurden Schmelztemperaturen des LAMP-Produkts von 90,7 ± 1,0 °C als spezifisch für verschiedene Isolate eingestuft.

TP-LAMP-Assay-Primer. LAMP-Primer basierten auf dem Stamm T. pecoris 19OD0592 (Acc. No. NZ_CP063212.1). Der Abgleich mit anderen T. pecoris-Genomen zeigte die hohe Erhaltung der Zielregion. Abfrage = T. pecoris-Stamm 19OD0592, CP071974.1 = T. pecoris-Stamm 15IMDO307, CP063213.1 = T. pecoris-Stamm 15A0121, CP053291.1 = T. pecoris-Stamm 19M2397.

Temperaturoptimierung des TP-LAMP-Assays. Die Nachweiszeiten werden für 0,5 pg positive Kontroll-DNA/25 µL des Stamms T. pecoris DSM 111392T als Funktion der verwendeten Reaktionstemperatur angezeigt. Markierungen und Fehlerindikatorbalken stellen den Mittelwert bzw. die Standardabweichung von drei unabhängigen Messungen dar.

Die analytische Spezifität des TP-LAMP-Assays wurde anhand von 44 Bakterienstämmen, darunter 11 T. pecoris-Isolaten unterschiedlicher Herkunft (Tabelle 1) und 33 Nichtzielspezies, bewertet. Inklusivität und Exklusivität des Assays betrugen jeweils 100 % in Bezug auf die getesteten Isolate (Tabelle 2).

Um die analytische Empfindlichkeit des TP-LAMP-Assays zu bestimmen, wurde zehnfach seriell verdünnte DNA getestet. In allen drei Wiederholungen konnte eine Mindestkonzentration von 0,5 pg DNA/25 µL nachgewiesen werden. Ein abnehmender DNA-Gehalt im Reaktionsgemisch war mit einer Abflachung der Amplifikationskurven und einem nichtlinearen Anstieg der Nachweiszeiten verbunden (Abb. 3A + B). Im Gegensatz dazu wurde bei einer Echtzeit-PCR, die auf dasselbe Amplikon wie TP LAMP abzielte, in allen drei Wiederholungen eine Mindestkonzentration von 50 fg DNA/25 µL festgestellt.

Analytische Empfindlichkeit des TP-LAMP-Assays. (A) Amplifikationskurven für zehnfach seriell verdünnte DNA von T. pecoris DSM 111392T. Charakteristisch für LAMP ist, dass die Amplifikationskurven mit abnehmender DNA-Konzentration flacher wurden. NTC = Nicht-Template-Steuerung. (B) Nachweiszeiten für zehnfach seriell verdünnte DNA von T. pecoris DSM 111392T als Funktion der DNA-Konzentration pro Reaktion. Markierungen und Fehlerindikatorbalken stellen den Mittelwert bzw. die Standardabweichung von drei unabhängigen Messungen dar. Mit abnehmender DNA-Konzentration stiegen die Nachweiszeiten nicht linear an. Aus diesem Grund war LAMP zur Quantifizierung der Zielarten nicht geeignet.

Die Bestimmung der zellbasierten Nachweisgrenzen des TP-LAMP-Assays basierte auf drei DNA-Extraktionsmethoden. Mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit konnten in allen drei Wiederholungen bis zu 6,0 × 102 KBE/25 µL durch TP LAMP nachgewiesen werden. Dies war 600-mal weniger empfindlich im Vergleich zur genomischen zielidentischen Echtzeit-PCR, die bis zu 1 KBE/20 µL nachweisen konnte. Die Nachweisgrenze des TP-LAMP-Assays verbesserte sich durch Einzelpufferextraktion auf 2,3 × 102 KBE/25 µL und erreichte nach einem zusätzlichen Erhitzungsschritt sogar 2,3 KBE/25 µL.

Künstlich kontaminierte Lungengewebeproben von Schweinen wurden getestet, um die Anwendungseignung des TP-LAMP-Assays unter dem Einfluss des Probenmaterials und der Hintergrundflora des Probentyps zu bewerten. Das Lungengewebe wurde bei Präparationen im Rahmen der Routinediagnostik an der Feldstation für Epidemiologie in Bakum (Tierärztliche Hochschule Hannover) entnommen. Die Nachweisgrenzen für die T. pecoris-Stämme DSM 111392T und 203/7 wurden mithilfe von drei an Abstrichproben angepassten DNA-Extraktionsmethoden bestimmt und bewertet. Entsprechende Ergebnisse in Bezug auf die Anzahl der Krankheitserreger pro Abstrich sind in Tabelle 3 aufgeführt. Unter Verwendung von Kit-extrahierter DNA war TP LAMP für die T. pecoris-Stämme DSM 111392T bzw. 203/7 100- bzw. 300-fach weniger empfindlich als Echtzeit-PCR . Alle Ergebnisse konnten jedoch eindeutig interpretiert werden und es traten keine falsch negativen Ergebnisse auf, wenn Proben mit TP LAMP getestet wurden. Im Gegensatz dazu führte die Echtzeit-PCR unter dem Einfluss der Probenmatrix häufig zu falsch positiven Signalen. Die Schmelzkurven der LAMP-Produkte waren immer einheitlich, wohingegen die Schmelzkurven der entsprechenden PCR-Produkte im Vergleich zur Positivkontrolle eine große Vielfalt an Profilen zeigten, mit überwiegend divergierenden, aber teilweise auch einheitlichen Schmelzpeaks.

Trueperella pecoris ist eine neuartige Bakterienart, die offenbar mit mehreren Tierkrankheiten in Zusammenhang steht, darunter Mastitis bei Rindern, Bronchopneumonie bei Schweinen und Beeinträchtigungen des Fortpflanzungstrakts bei Wiederkäuern1,4. Darüber hinaus legt das Vorkommen von T. pecoris in der Milchdrüse von Rindern nahe, dass auch eine Infektion des Menschen durch den Verzehr kontaminierter Milch in Betracht gezogen werden sollte, da die humanpathogenen Eigenschaften von Trueperella spp. werden in der Literatur häufig beschrieben14, 15 Die verfügbaren Daten lassen jedoch keine eindeutigen Rückschlüsse darauf zu, ob T. pecoris tatsächlich als Krankheitserreger auftritt. In dieser Studie wurde ein Nachweissystem entwickelt, das eine spezifische Diagnostik in klinischen Proben ermöglicht und so dabei hilft, epidemiologische Daten zu generieren und die pathogene Bedeutung des Bakteriums zu klären.

Die Primer des TP-LAMP-Assays basierten auf einer Genregion, die eine Peptidase der S9-Familie kodiert, die sich durch BLAST-Analyse als einzigartig in T. pecoris erwiesen hat. Die Funktionen dieser Enzyme wurden bisher am besten am Menschen untersucht und sind mit komplexen immunologischen und hormonellen Stoffwechselprozessen verbunden16. Es ist davon auszugehen, dass die gezielte Peptidase der S9-Familie auch im Stoffwechsel von T. pecoris eine Schlüsselrolle spielt und das kodierende Gen ständig im Bakteriengenom vorhanden und konserviert ist. Dies spiegelte sich in der hohen Inklusivität des TP-LAMP-Assays für Zielarten und der Exklusivität für Nichtzielarten wider.

Die Leistungen von TP-LAMP und PCR, die auf dasselbe Amplikon abzielen, wurden im Hinblick auf die analytische Empfindlichkeit verglichen. In der Literatur gibt es einen echten Wettbewerb zwischen den beiden Amplifikationstechniken, wobei oft betont wird, dass LAMP PCR10 überlegen ist. Dies muss jedoch differenziert betrachtet werden. Beispielsweise erreicht LAMP in der Regel nur im Vergleich zur herkömmlichen PCR eine höhere analytische Sensitivität17, 18. Betrachtet man die Ergebnisse der Echtzeit-PCR, werden häufig ähnliche oder sogar schlechtere Nachweisgrenzen erhalten19,20. Daher war es nicht ungewöhnlich, dass der in dieser Studie vorgestellte TP-LAMP-Assay eine zehnmal geringere analytische Empfindlichkeit aufwies als die Echtzeit-PCR. Der TP-LAMP-Assay konnte diesen Unterschied durch weitere vorteilhafte Eigenschaften ausgleichen und war der Echtzeit-PCR insbesondere bei der Testung komplexer Probenmatrices überlegen.

Bei der Untersuchung der zellbasierten Nachweisgrenze kam es interessanterweise zu einem erheblichen Empfindlichkeitsverlust, als die mit dem Kit extrahierte DNA getestet wurde. Im Gegensatz dazu konnte die Leistung des TP-LAMP-Assays durch LPTV-Pufferextraktion mit zusätzlicher Erwärmung verbessert werden, was höchstwahrscheinlich auf eine vergleichsweise höhere DNA-Ausbeute zurückzuführen war. Darüber hinaus zeichnet sich diese DNA-Extraktionsmethode durch ihre Schnelligkeit und ihre Eignung für den Einsatz vor Ort aus. Allerdings sind keine Waschschritte enthalten, was bedeutet, dass die hemmenden Komponenten nicht entfernt werden. Dies stellt regelmäßig ein Problem für die PCR-Diagnostik dar, da unzureichend prozessierte DNA-Templates von geringer Qualität mit einer Unterdrückung der Amplifikation und falsch negativen Ergebnissen verbunden sein können21. Im Gegensatz dazu ist LAMP für seine Fähigkeit bekannt, mit potenziellen Inhibitoren umzugehen22, wodurch die Methode mit einfachen, schnellen und kostengünstigen DNA-Präparationstechniken kompatibel ist.

Der TP-LAMP-Assay zeigte auch die zuvor beschriebenen Eigenschaften, wenn er an Lungengewebeproben von Schweinen getestet wurde. Diese Matrix wurde ausgewählt, da sie möglicherweise ein potenzielles Zielorgan für eine Infektion mit T. pecoris1 darstellt. Sowohl Gewebepartikel als auch Blut hafteten an den entnommenen Abstrichproben und enthielten somit mehrere hemmende Komponenten wie Hämoglobin, Lactoferrin oder Immunglobulin G23,24. Ähnlich wie die vorherigen Ergebnisse dieser Studie zeigte TP LAMP im Vergleich zur Echtzeit-PCR eine geringere Empfindlichkeit für mit dem Kit extrahierte DNA-Proben, konnte diese Einschränkung jedoch kompensieren, wenn Templates aus der LPTV-Pufferextraktion mit anschließendem Erhitzen verwendet wurden. Unterschiede zwischen TP LAMP und Real-Time-PCR hinsichtlich der Sensitivität in komplexen Proben können jedoch nur bedingt ausgewertet werden, da es bei der Real-Time-PCR-Untersuchung häufig zu falsch positiven Reaktionen kam. Im Gegensatz dazu konnten alle TP-LAMP-Reaktionen eindeutig interpretiert werden und zeigten keine falsch positiven Ergebnisse, was die Robustheit dieses Tests untermauert.

Für die Diagnose von T. pecoris steht derzeit keine kulturelle oder biomolekulare Referenzmethode zur Verfügung, so dass die Identifizierung des Bakteriums bislang nur über die ungerichtete Sammlung verdächtiger Isolate und anschließende aufwendige und zeitaufwändige Sequenzanalysen möglich ist. Folglich wäre es erforderlich, geeignetes Probenmaterial von infizierten Tieren während geeigneter Studien und anschließender Tests durch TP LAMP sicherzustellen, um die Validierung dieses Tests endgültig abzuschließen. Da bisher nur die 11 in Tabelle 1 aufgeführten T. pecoris-Stämme isoliert wurden, wird dieser Prozess voraussichtlich einen längeren Zeitraum in Anspruch nehmen und konnte in dieser Studie nicht behandelt werden. Über das zoonotische Potenzial dieser Art liegen noch keine Erkenntnisse vor. Sollte die Übertragung auf den Menschen jedoch durch Lebensmittel produzierende Tiere erfolgen, sollte die Validierung des TP-LAMP-Assays auch auf Fleisch- und Milchproben ausgeweitet werden.

Zusammenfassend stellt der in dieser Studie beschriebene TP-LAMP-Assay die erste verfügbare Methode zur Diagnose von T. pecoris-Infektionen in komplexen Probenmaterialien dar. Die Tatsache, dass der Assay das Bakterium mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit in nicht gereinigten Vorlagen nachweist, reduziert die Kosten, den Arbeitsaufwand und die Zeit für die Probenanalyse und sorgt gleichzeitig für eine hohe Zuverlässigkeit der Ergebnisse. Dies sind geeignete Bedingungen für die Durchführung groß angelegter Prävalenzstudien, da der TP-LAMP-Assay sowohl unter Labor- als auch unter Feldbedingungen eingesetzt werden kann. Die nun mit der TP-LAMP-Diagnostik erfassbaren Daten können verarbeitet werden, um Rückschlüsse auf die Pathogenität von T. pecoris bei Menschen und Tieren zu ziehen, die Gegenstand zukünftiger Studien sein sollten.

Die Sequenz des T. pecoris-Stammes 19OD0592 diente als Grundlage für die Entwicklung von sechs spezifischen LAMP-Primern unter Verwendung der LAMP-Designer-Software Version 1.15 (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA). Die Sequenzdaten wurden aus der GenBank-Datenbank (Zugriffsnummer NZ_CP063212.1) entnommen, die von NCBI (Bethesda, USA) bereitgestellt wurde. Zur Bestimmung einer artspezifischen Sequenzregion wurden Abschnitte des T. pecoris-Genoms sukzessive mit anderen bei der GenBank verfügbaren Sequenzdaten unter Verwendung des Megablast-Algorithmus des integrierten Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (NCBI) abgeglichen. Nach dem Import der ausgewählten Daten in die LAMP-Designer-Software wurden verschiedene LAMP-Primer mit Standardparametern generiert und dem integrierten Primer BLAST25 unterzogen. Anschließend wurde ein geeigneter Primersatz, bestehend aus vier Basis- und zwei Loop-Primern, basierend auf der Rangfolge durch die Software und nach optimalen Spezifitätseigenschaften ausgewählt (Abb. 1). Die Produktion der LAMP-Primer wurde an die Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Deutschland) vergeben.

Alle LAMP-Reaktionen wurden mit dem Echtzeit-Fluorometer Genie II® von OptiGene Ltd. (Horsham, UK) durchgeführt. Das Gerät ist mit einem wiederaufladbaren Akku ausgestattet und kann vor Ort per Touchscreen bedient werden, was auch eine direkte Ergebnisvisualisierung ermöglicht. Um die optimale Zusammensetzung der einzelnen TP-LAMP-Primer in einem Reaktionsgemisch zu bestimmen, wurden zwei Primersätze, bestehend aus einer Standard- und einer konzentrierten Version, gemäß den Empfehlungen von OptiGene Ltd. hergestellt. Unter Verwendung des Standard-TP-Primersatzes wurden die Konzentrationen der Primer bestimmt F3 und B3, die Primer FIP und BIP sowie die Primer LF und LB in einem Reaktionsgemisch betrugen 0,2 µM, 0,8 µM bzw. 0,4 µM. Im Gegensatz dazu betrugen die Konzentrationen der Primer F3 und B3, der Primer FIP und BIP sowie der Primer LF und LB in einem Reaktionsgemisch 0,2 µM, 2,0 µM bzw. 1,0 µM, wenn die konzentrierte Version des TP-Primersets verwendet wurde. Jede Reaktionsmischung mit einem Gesamtvolumen von 25 µL enthielt 15 µL GspSSD Isothermal Mastermix (ISO-001) (OptiGene Ltd.), 2,5 µL Primermix, 2,5 µL nukleasefreies Wasser (NFW) und 5 µL DNA-Matrize. Der optimale Primersatz wurde anhand der erreichten Nachweiszeiten für standardisierte DNA (0,1 ng/µL) aus dem T. pecoris-Referenzstamm DSM 111392T und dem T. pecoris-Feldstamm 203/7 ausgewählt. Anschließend wurde die Reaktionstemperatur des TP-LAMP-Assays für den ausgewählten Primersatz optimiert, indem standardisierte DNA (0,1 ng/µL) aus dem T. pecoris-Referenzstamm DSM 111392T unter Verwendung eines Temperaturgradienten zwischen 62 und 69 °C auf dem Genie II® ausgewertet wurde Instrument. Für nachfolgende LAMP-Tests wurde die Temperatur verwendet, bei der die niedrigsten Nachweiszeiten gemessen wurden. Optimierungsexperimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und mit der Anwendungssoftware Genie Explorer Version 2.0.7.11 (OptiGene Ltd.) unter Verwendung von Standardparametern ausgewertet. Jeder Lauf umfasste eine positive und negative Kontrollreaktion unter Verwendung der T. pecoris DSM 111392T-DNA-Matrize (0,1 ng/µL) bzw. NFW.

Um die Leistung beider Amplifikationstechniken zu vergleichen, wurde ein Echtzeit-PCR-Assay entwickelt, der auf dasselbe Amplifikat wie der TP-LAMP-Assay abzielt. Zu diesem Zweck wurden die LAMP-Primer TP-F3 und TP-B3 als Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer im Echtzeit-PCR-Assay verwendet. Jede Reaktion hatte ein Gesamtvolumen von 20 µL und enthielt 10 µL FastStart Essential DNA Green Master (Roche), 1 µL TP-F3- und TP-B3-Primer (10 µM), 3 µL H2O und 5 µL DNA-Matrize. Die Läufe begannen mit einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 45 Zyklen dreistufiger Amplifikation und Schmelzen. Die dreistufige Amplifikation umfasste eine Denaturierung bei 95 °C für 10 s, ein Annealing bei 60 °C für 10 s und eine Elongation bei 72 °C für 10 s mit Anstiegsraten von 4,4, 2,2 und 4,4 °C. jeweils. Nach jedem Elongationsschritt wurden Fluoreszenzsignale gemessen. Schmelzkurven wurden unter Verwendung eines Temperatur-Zeit-Profils von 95 °C für 10 s, 65 °C für 60 s und 97 °C für 1 s erstellt. Wie beim TP-LAMP-Assay wurden in jedem Lauf T. pecoris DSM 111392T-DNA-Template (0,1 ng/µL) und NFW als Positiv- bzw. Negativkontrolle verwendet.

Zur DNA-Extraktion wurden alle Bakterien gemäß artspezifischen Anforderungen auf Columbia-Schafblutagar (Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland) gezüchtet. Escherichia coli-, Enterococcus faecalis- und Enterococcus faecium-Isolate wurden 24 Stunden lang bei 37 °C unter aeroben Bedingungen inkubiert. Im Gegensatz dazu wurde für die Kultivierung von Trueperella spp. eine Kerzenglasatmosphäre verwendet. und Arcanobacterium spp. für 24–48 h bei 37 °C. Zur Isolierung der DNA wurde mit geringfügigen Modifikationen das DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) verwendet. Anstatt Bakterienzellen aus Flüssigkulturen durch Zentrifugieren zu ernten, wurden 5–10 Kolonien grampositiver oder gramnegativer Bakterien von Agarplatten gepflückt und direkt in enzymatischem Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 2 mM Natrium-EDTA) resuspendiert ; 1,2 % Triton® X-100; Lysozym, 20 mg/ml) bzw. ATL-Puffer. Die folgenden Schritte zur DNA-Extraktion wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Zur Prüfung der analytischen Spezifität des TP-LAMP-Assays wurden insgesamt 44 Bakterienisolate verwendet (Tabelle 2). Die Stämme stammen aus der hauseigenen Kultursammlung des Instituts für Lebensmittelqualität und Lebensmittelsicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (Hannover, Deutschland), der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Deutschland), der Nationalen Sammlung von Type Cultures (Salisbury, UK) und von der RIPAC-LABOR GmbH (Potsdam, Deutschland, europäische Stammdatenbank ENOVAT). Für die Inklusivitätsprüfung wurden zuvor beschriebene T. pecoris-Stämme, die von Rindern und Kamelen stammen1,4, sowie weitere T. pecoris-Isolate berücksichtigt (Tabelle 1). Positive Ergebnisse wurden durch das Auftreten eines Fluoreszenzsignals definiert, das mit einer bestimmten Schmelztemperatur verbunden war. Die für den Exklusivitätstest verwendeten Stämme wurden aufgrund ihrer engen genetischen Verwandtschaft mit T. pecoris und ihrer Koexistenz in derselben Umgebung ausgewählt.

Die analytische Sensitivität des TP-LAMP-Assays wurde anhand zehnfach seriell verdünnter DNA des Stammes T. pecoris DSM 111392T bestimmt. Als Verdünnungsmedium wurde AE-Puffer aus dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) verwendet. Die DNA-Konzentrationen wurden auf 1 ng/µL bis 1 fg/µL eingestellt und jede Vorlage wurde dreifach mit TP LAMP getestet. Zum Vergleich wurde jede Vorlage auch dreimal per Echtzeit-PCR untersucht. Die analytische Sensitivität wurde als die minimale DNA-Menge pro Reaktion definiert, bei der die Ergebnisse in allen drei Replikaten positiv waren.

Drei verschiedene DNA-Extraktionsmethoden, darunter eine Kit-basierte Methode zur Gewinnung hochreiner DNA sowie eine Einzelpufferextraktion und eine Einzelpufferextraktion mit Erhitzen, beide angepasst für die Anwendung vor Ort, wurden zur Isolierung von DNA aus T. verwendet. Pecoris-Zellsuspensionen und Abstrichproben von Schweinelungengewebe. Die kitbasierte Extraktion wurde mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die erforderlichen Inkubationsschritte bei 37 °C und 56 °C dauerten jeweils 1 Stunde. Um die Empfindlichkeit von LAMP und PCR zu vergleichen, wurden alle kitbasierten Isolate mit beiden Methoden getestet. Unter Anwendung der Einzelpufferextraktionsmethode wurden Pellets in 500 µL LPTV-Puffer (AmplexDiagnostics GmbH, Gars am Inn, Deutschland) suspendiert, 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und direkt ausschließlich mit TP LAMP getestet. Anschließend wurden dieselben LPTV-Zellsuspensionen 10 Minuten lang auf 100 °C erhitzt und erneut getestet.

Die zellbasierte Nachweisgrenze des TP-LAMP-Assays wurde durch zehnfach seriell verdünnte Zellsuspensionen bestimmt. Zu diesem Zweck wurde der Stamm T. pecoris DSM 111392T 48 Stunden lang bei 37 °C in einem Kerzenglas gezüchtet. Das Koloniematerial wurde in 5 ml NaCl-Lösung (0,9 %) suspendiert, bis eine Trübung von 2,0 McFarland-Einheiten (MFU) erreicht war. Anschließend wurde die Suspension unter Verwendung von 9-ml-Maximum-Recovery-Diluent-Röhrchen (Oxoid Deutschland GmbH) zehnfach seriell von 10–1 auf 10–8 verdünnt. DNA wurde wie zuvor beschrieben aus Zellpellets extrahiert, die aus 1 ml jeder Verdünnungsstufe erhalten wurden, nachdem die 1-ml-Aliquots 10 Minuten lang bei 7500 U/min zentrifugiert wurden. Überstände wurden sorgfältig verworfen. Jeder Isolierungsvorgang wurde dreimal wiederholt. Die Nachweisgrenze wurde als die minimale T. pecoris-Zellzahl definiert, bei der die Ergebnisse in allen drei Replikaten positiv waren.

Zur Beurteilung der Eignung der TP-LAMP-Methode unter dem Einfluss der Probenmatrix und ihrer Hintergrundflora wurden Abstrichproben aus Schweinelungengewebe entnommen und künstlich mit T. pecoris kontaminiert. Zur künstlichen Kontamination wurden der Stamm T. pecoris DSM 111392T und der kamelassoziierte T. pecoris-Stamm 203/7 verwendet. Zu diesem Zweck wurden die Stämme 48 Stunden lang bei 37 °C in einem Kerzenglas gezüchtet und es wurden dezimale Verdünnungsreihen wie zuvor beschrieben hergestellt. Die Lungenoberfläche eines klinisch gesunden Schweins sowie tiefere Gewebeschichten, die durch einen sterilen Schnitt in das Lungengewebe geöffnet wurden, wurden mit einem sterilen Wattestäbchen abgetupft. Anschließend wurde der Tupfer in ein mit 900 µL MRD gefülltes 1,5-mL-Reaktionsröhrchen überführt, wiederholt gedreht und schließlich an der Wand herausgedrückt. Für jeden Stamm wurden 10 Röhrchen vorbereitet. Von jeder Verdünnungsstufe der beiden Stammzellsuspensionen wurden 100 µL entnommen und dem Abstrichmaterial mit MRD-Medium zugesetzt. Ein Röhrchen pro Stamm blieb nicht beimpft und diente als negative Extraktionskontrolle. Nach 10-minütiger Zentrifugation der Röhrchen bei 7500 U/min wurden die Überstände sorgfältig verworfen. Für die DNA-Extraktion wurden Pellets wie zuvor beschrieben verwendet. Der Versuch wurde dreimal an drei aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt. Die Nachweisgrenze in Lungengewebeproben von Schweinen wurde als die durchschnittliche T. pecoris-Zellzahl pro Abstrich definiert, bei der die Ergebnisse in allen drei Wiederholungen positiv waren.

Die während der LAMP- und PCR-Läufe generierten Daten wurden mit der Anwendungssoftware Genie Explorer Version 2.0.7.11 und Light Cycler® 96, Version 1.1.0.1320, analysiert, die von den jeweiligen Geräteherstellern bereitgestellt wurde. Die Rohdatenverarbeitung und statistischen Analysen wurden mit Microsoft Excel Version 2303 durchgeführt.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Silke Ortaeri und Anke Bertling für ihre hervorragende technische Unterstützung. Dank geht auch an Manfred Merle für die Bearbeitung der Illustrationen zur Veröffentlichung.

Diese Open-Access-Publikation wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) – 491094227 „Open-Access-Publikationsförderung“ und die Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Institut für Lebensmittelqualität und Lebensmittelsicherheit, Tierärztliche Hochschule Hannover, Bischofsholer Damm 15, 30173, Hannover, Deutschland

Antonia Kreitlow, Madeleine Plötz & Amir Abdulmawjood

Fakultät für Veterinärmedizin, Wijaya Kusuma University Surabaya, Jl. Dukuh Kupang XXV Nr. 54, Dukuh Kupang, Surabaya, 60225, Indonesien

Siti Gusti Ningrum

Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere, Justus-Liebig-Universität Gießen, Frankfurter Str. 87-89, 35392, Gießen, Deutschland

Christoph Lämmler & Christiane Hoffmann

RIPAC-LABOR GmbH, Am Mühlenberg 11, 14476, Potsdam, Deutschland

Marcel Erhard

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AK, CL und AA waren für die Konzeption des Projekts verantwortlich. AK entwarf die Experimente und verfasste den Originalentwurf des Manuskripts. AK und SGN führten Experimente durch. AK, SGN und AA analysierten die Daten. ME und CH lieferten T. pecoris-Stämme. MP betreute das Projekt. Alle Autoren haben die endgültige Version des Papiers überarbeitet und genehmigt.

Korrespondenz mit Amir Abdulmawjood.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kreitlow, A., Ningrum, SG, Lämmler, C. et al. Identifizierung des neuen potenziellen Erregers Trueperella pecoris mit Interspezies-Bedeutung durch LAMP-Diagnostik. Sci Rep 13, 14005 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40787-1

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Eingegangen: 02. Juni 2023

Angenommen: 16. August 2023

Veröffentlicht: 27. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40787-1

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